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恰塔努加链霉菌纳他霉素高效生物合成的分子机制

摘要第6-8页
Abstract第8-10页
缩略词和术语表第11-14页
第一章 绪论第14-30页
    1.1 链霉菌的形态发育第14-17页
    1.2 纳他霉素生物合成研究进展第17-21页
        1.2.1 纳他霉素的生物合成基因簇第17-19页
        1.2.2 纳他霉素内酯环合成的起始第19页
        1.2.3 纳他霉素内酯环合成的延伸第19-20页
        1.2.4 纳他霉素内酯环的后修饰第20-21页
    1.3 纳他霉素生物合成调控机制第21-24页
        1.3.1 途径特异性调控因子第21-22页
        1.3.2 全局多效调控第22-24页
    1.4 次级代谢产物产量的提高及其代谢酶的研究策略第24-28页
        1.4.1 高表达正相关结构基因第24-25页
        1.4.2 敲除负相关结构基因第25-26页
        1.4.3 体外稳态动力学分析次级代谢酶浓度的适配性第26-27页
        1.4.4 体内分析次级代谢酶的可用诱导型启动子第27-28页
    1.5 本文的研究内容及意义第28-30页
        1.5.1 本文的研究内容第28-29页
        1.5.2 本课题的意义第29-30页
第二章 纳他霉素合成途径的后修饰机制解析第30-61页
    2.1 引言第30页
    2.2 实验材料第30-37页
        2.2.1 菌株第30-31页
        2.2.2 质粒第31-32页
        2.2.3 引物第32-34页
        2.2.4 主要仪器与设备第34-35页
        2.2.5 培养基及培养条件第35-36页
        2.2.6 常用试剂第36-37页
    2.3 实验方法第37-45页
        2.3.1 S.chattanoogensis基因组DNA的抽提第37-38页
        2.3.2 DNA片段的PCR扩增第38-39页
        2.3.3 DNA片断的处理第39页
        2.3.4 大肠杆菌质粒抽提第39-40页
        2.3.5 大肠杆菌Cosmid抽提第40页
        2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备第40页
        2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的转化第40-41页
        2.3.8 孢子悬液的制备第41页
        2.3.9 S.chattanoogensis和E.coli ET12567的属间接合转导第41页
        2.3.10 PCR-targeting基因敲除第41-42页
        2.3.11 S chattanoogensis单交换突变株的获得第42页
        2.3.12 S.chattanoogensis双交换突变株的获得第42页
        2.3.13 S.chattanoogensis发酵、产物处理、HPLC和ESI-MS检测第42-43页
        2.3.14 RNA的抽提、基因组DNA的消解、反转录及qRT-PCR第43-45页
        2.3.15 纳他霉素生物指示试验第45页
    2.4 实验结果第45-57页
        2.4.1 基因缺失株构建与验证第45-48页
        2.4.2 基因缺失株的回补菌株构建与验证第48-49页
        2.4.3 纳他霉素生物合成过程中两个中间代谢产物的鉴定第49-50页
        2.4.4 scnD缺失株产物鉴定第50-52页
        2.4.5 scnK、scnJ和scnC缺失株产物鉴定第52-53页
        2.4.6 scnG缺失株产物鉴定第53-55页
        2.4.7 scnF的缺失导致纳他霉素产量下降第55页
        2.4.8 外源糖基转移酶回补scnK缺失株第55-56页
        2.4.9 纳他霉素类似物的抗真菌活性分析第56-57页
    2.5 本章小结与讨论第57-61页
第三章 纳他霉素高效生物合成的分子机制第61-79页
    3.1 引言第61页
    3.2 实验材料第61-64页
        3.2.1 菌株第61-62页
        3.2.2 质粒第62-63页
        3.2.3 引物第63页
        3.2.4 主要仪器与设备第63页
        3.2.5 培养基及培养条件第63页
        3.2.6 常用试剂第63-64页
    3.3 实验方法第64-65页
        3.3.1 本章所用分子生物学操作与链霉菌培养条件等方法同2.3第64页
        3.3.2 链霉菌重组蛋白的表达第64页
        3.3.3 链霉菌总蛋白的提取及SDS-PAGE和Western Blot检测第64-65页
    3.4 实验结果第65-76页
        3.4.1 系列诱导载体的构建过程第65-67页
        3.4.2 恰塔努加链霉菌egfp基因体内绿色荧光表达第67-68页
        3.4.3 最佳诱导浓度的确定第68-69页
        3.4.4 最佳诱导剂添加时间的确定第69-70页
        3.4.5 不同浓度的IPTG对恰塔努加链霉菌生长和纳他霉素产量的影响第70页
        3.4.6 梯度控制糖基转移酶ScnK的表达对纳他霉素合成的影响第70-72页
        3.4.7 梯度控制GDP-甘露糖脱氢酶ScnJ的表达对纳他霉素产量的影响第72-73页
        3.4.8 梯度控制氨基转移酶ScnC的表达对纳他霉素产量的影响第73-75页
        3.4.9 梯度控制P450单加氧酶ScnD的表达对纳他霉素产量的影响第75-76页
    3.5 本章小结与讨论第76-79页
第四章 纳他霉素高速生物合成途径的构建第79-93页
    4.1 引言第79页
    4.2 实验材料第79-81页
        4.2.1 菌株第79-80页
        4.2.2 质粒载体第80页
        4.2.3 引物第80-81页
        4.2.4 主要仪器与设备第81页
        4.2.5 培养基及培养条件第81页
    4.3 实验方法第81-82页
        4.3.1 本章所用分子生物学操作与链霉菌培养条件等方法同2.3第81页
        4.3.2 发酵罐发酵培养第81-82页
    4.4 实验结果第82-91页
        4.4.1 系列高表达质粒的构建过程第82-83页
        4.4.2 高表达糖基转移酶基因scnK对纳他霉素产量的影响第83-85页
        4.4.3 高表这P450单加氧酶对纳他霉素产量的影响第85-86页
        4.4.4 高亲达GDP-甘露糖脱水酶和氨基转移酶对纳他霉素产量的影响第86-87页
        4.4.5 组合高表达海藻糖胺合成及转移相关酶对纳他霉素产量的影响第87页
        4.4.6 利用两套位点特异性重组体系同时官表达scnK/C和scnZ)第87页
        4.4.7 基因重姐菌株在转录水平上的qRT-PC民分析第87-88页
        4.4.8 纳他霉素高产菌株在工业培养基中发酵验证第88页
        4.4.9 摇瓶发酵过程中pH值和还原糖浓度的时间曲线第88-89页
        4.4.10 优化pH对纳他霉素产量的影响第89页
        4.4.11 优化发酵培养基的萄荀糖浓度W提高纳他霉素的发酵产量第89-90页
        4.4.12 发酵罐小试发酵工艺放大第90-91页
    4.5 本章小结与讨论第91-93页
第五章 合成途爸与形态分化的协同祝制第93-113页
    5.1 前言第93页
    5.2 实验材辑第93-96页
        5.2.1 菌巧第93页
        5.2.2 质粒载体第93-95页
        5.2.3 引物第95页
        5.2.4 主要仪器与设备第95-96页
        5.2.5 培养基及培养条件第96页
        5.2.6 常用试剂第96页
    5.3 实验方法第96-98页
        5.3.1 蛋白在大烦巧菌中的异源表达及纯化第96-97页
        5.3.2 凝胶阻滞电泳第97页
        5.3.3 DNasel Footprinting第97-98页
        5.3.4 基因患片分析第98页
    5.4 实验结栗第98-110页
        5.4.1 WhiG_(ch)序列分析第98-99页
        5.4.2 wWG_(ch)突变株的构建与验证第99-101页
        5.4.3 WhiC_(ch)对形态分化的影口向第101页
        5.4.4 WhiG_(ch)对纳他霉素产量的影响第101-103页
        5.4.5 ZJUL31菌株中巧/和内W/的转录水平分析第103页
        5.4.6 WhiG_(ch)直接结合到纳他霉素合成基因启动子区第103-104页
        5.4.7 WhiG_(ch)结合序列的确定第104-105页
        5.4.8 转录水平受影响的基因第105-110页
    5.5 本章小结与讨论第110-113页
第六章 本文研究成果及展望第113-115页
    6.1 本文研究成果第113页
    6.2 展望第113-115页
参考文献第115-128页
附录第128-129页
攻读博士学位期间的主要研究成果第129-130页
致谢第130页

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