| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词和术语表 | 第11-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-30页 |
| 1.1 链霉菌的形态发育 | 第14-17页 |
| 1.2 纳他霉素生物合成研究进展 | 第17-21页 |
| 1.2.1 纳他霉素的生物合成基因簇 | 第17-19页 |
| 1.2.2 纳他霉素内酯环合成的起始 | 第19页 |
| 1.2.3 纳他霉素内酯环合成的延伸 | 第19-20页 |
| 1.2.4 纳他霉素内酯环的后修饰 | 第20-21页 |
| 1.3 纳他霉素生物合成调控机制 | 第21-24页 |
| 1.3.1 途径特异性调控因子 | 第21-22页 |
| 1.3.2 全局多效调控 | 第22-24页 |
| 1.4 次级代谢产物产量的提高及其代谢酶的研究策略 | 第24-28页 |
| 1.4.1 高表达正相关结构基因 | 第24-25页 |
| 1.4.2 敲除负相关结构基因 | 第25-26页 |
| 1.4.3 体外稳态动力学分析次级代谢酶浓度的适配性 | 第26-27页 |
| 1.4.4 体内分析次级代谢酶的可用诱导型启动子 | 第27-28页 |
| 1.5 本文的研究内容及意义 | 第28-30页 |
| 1.5.1 本文的研究内容 | 第28-29页 |
| 1.5.2 本课题的意义 | 第29-30页 |
| 第二章 纳他霉素合成途径的后修饰机制解析 | 第30-61页 |
| 2.1 引言 | 第30页 |
| 2.2 实验材料 | 第30-37页 |
| 2.2.1 菌株 | 第30-31页 |
| 2.2.2 质粒 | 第31-32页 |
| 2.2.3 引物 | 第32-34页 |
| 2.2.4 主要仪器与设备 | 第34-35页 |
| 2.2.5 培养基及培养条件 | 第35-36页 |
| 2.2.6 常用试剂 | 第36-37页 |
| 2.3 实验方法 | 第37-45页 |
| 2.3.1 S.chattanoogensis基因组DNA的抽提 | 第37-38页 |
| 2.3.2 DNA片段的PCR扩增 | 第38-39页 |
| 2.3.3 DNA片断的处理 | 第39页 |
| 2.3.4 大肠杆菌质粒抽提 | 第39-40页 |
| 2.3.5 大肠杆菌Cosmid抽提 | 第40页 |
| 2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第40页 |
| 2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第40-41页 |
| 2.3.8 孢子悬液的制备 | 第41页 |
| 2.3.9 S.chattanoogensis和E.coli ET12567的属间接合转导 | 第41页 |
| 2.3.10 PCR-targeting基因敲除 | 第41-42页 |
| 2.3.11 S chattanoogensis单交换突变株的获得 | 第42页 |
| 2.3.12 S.chattanoogensis双交换突变株的获得 | 第42页 |
| 2.3.13 S.chattanoogensis发酵、产物处理、HPLC和ESI-MS检测 | 第42-43页 |
| 2.3.14 RNA的抽提、基因组DNA的消解、反转录及qRT-PCR | 第43-45页 |
| 2.3.15 纳他霉素生物指示试验 | 第45页 |
| 2.4 实验结果 | 第45-57页 |
| 2.4.1 基因缺失株构建与验证 | 第45-48页 |
| 2.4.2 基因缺失株的回补菌株构建与验证 | 第48-49页 |
| 2.4.3 纳他霉素生物合成过程中两个中间代谢产物的鉴定 | 第49-50页 |
| 2.4.4 scnD缺失株产物鉴定 | 第50-52页 |
| 2.4.5 scnK、scnJ和scnC缺失株产物鉴定 | 第52-53页 |
| 2.4.6 scnG缺失株产物鉴定 | 第53-55页 |
| 2.4.7 scnF的缺失导致纳他霉素产量下降 | 第55页 |
| 2.4.8 外源糖基转移酶回补scnK缺失株 | 第55-56页 |
| 2.4.9 纳他霉素类似物的抗真菌活性分析 | 第56-57页 |
| 2.5 本章小结与讨论 | 第57-61页 |
| 第三章 纳他霉素高效生物合成的分子机制 | 第61-79页 |
| 3.1 引言 | 第61页 |
| 3.2 实验材料 | 第61-64页 |
| 3.2.1 菌株 | 第61-62页 |
| 3.2.2 质粒 | 第62-63页 |
| 3.2.3 引物 | 第63页 |
| 3.2.4 主要仪器与设备 | 第63页 |
| 3.2.5 培养基及培养条件 | 第63页 |
| 3.2.6 常用试剂 | 第63-64页 |
| 3.3 实验方法 | 第64-65页 |
| 3.3.1 本章所用分子生物学操作与链霉菌培养条件等方法同2.3 | 第64页 |
| 3.3.2 链霉菌重组蛋白的表达 | 第64页 |
| 3.3.3 链霉菌总蛋白的提取及SDS-PAGE和Western Blot检测 | 第64-65页 |
| 3.4 实验结果 | 第65-76页 |
| 3.4.1 系列诱导载体的构建过程 | 第65-67页 |
| 3.4.2 恰塔努加链霉菌egfp基因体内绿色荧光表达 | 第67-68页 |
| 3.4.3 最佳诱导浓度的确定 | 第68-69页 |
| 3.4.4 最佳诱导剂添加时间的确定 | 第69-70页 |
| 3.4.5 不同浓度的IPTG对恰塔努加链霉菌生长和纳他霉素产量的影响 | 第70页 |
| 3.4.6 梯度控制糖基转移酶ScnK的表达对纳他霉素合成的影响 | 第70-72页 |
| 3.4.7 梯度控制GDP-甘露糖脱氢酶ScnJ的表达对纳他霉素产量的影响 | 第72-73页 |
| 3.4.8 梯度控制氨基转移酶ScnC的表达对纳他霉素产量的影响 | 第73-75页 |
| 3.4.9 梯度控制P450单加氧酶ScnD的表达对纳他霉素产量的影响 | 第75-76页 |
| 3.5 本章小结与讨论 | 第76-79页 |
| 第四章 纳他霉素高速生物合成途径的构建 | 第79-93页 |
| 4.1 引言 | 第79页 |
| 4.2 实验材料 | 第79-81页 |
| 4.2.1 菌株 | 第79-80页 |
| 4.2.2 质粒载体 | 第80页 |
| 4.2.3 引物 | 第80-81页 |
| 4.2.4 主要仪器与设备 | 第81页 |
| 4.2.5 培养基及培养条件 | 第81页 |
| 4.3 实验方法 | 第81-82页 |
| 4.3.1 本章所用分子生物学操作与链霉菌培养条件等方法同2.3 | 第81页 |
| 4.3.2 发酵罐发酵培养 | 第81-82页 |
| 4.4 实验结果 | 第82-91页 |
| 4.4.1 系列高表达质粒的构建过程 | 第82-83页 |
| 4.4.2 高表达糖基转移酶基因scnK对纳他霉素产量的影响 | 第83-85页 |
| 4.4.3 高表这P450单加氧酶对纳他霉素产量的影响 | 第85-86页 |
| 4.4.4 高亲达GDP-甘露糖脱水酶和氨基转移酶对纳他霉素产量的影响 | 第86-87页 |
| 4.4.5 组合高表达海藻糖胺合成及转移相关酶对纳他霉素产量的影响 | 第87页 |
| 4.4.6 利用两套位点特异性重组体系同时官表达scnK/C和scnZ) | 第87页 |
| 4.4.7 基因重姐菌株在转录水平上的qRT-PC民分析 | 第87-88页 |
| 4.4.8 纳他霉素高产菌株在工业培养基中发酵验证 | 第88页 |
| 4.4.9 摇瓶发酵过程中pH值和还原糖浓度的时间曲线 | 第88-89页 |
| 4.4.10 优化pH对纳他霉素产量的影响 | 第89页 |
| 4.4.11 优化发酵培养基的萄荀糖浓度W提高纳他霉素的发酵产量 | 第89-90页 |
| 4.4.12 发酵罐小试发酵工艺放大 | 第90-91页 |
| 4.5 本章小结与讨论 | 第91-93页 |
| 第五章 合成途爸与形态分化的协同祝制 | 第93-113页 |
| 5.1 前言 | 第93页 |
| 5.2 实验材辑 | 第93-96页 |
| 5.2.1 菌巧 | 第93页 |
| 5.2.2 质粒载体 | 第93-95页 |
| 5.2.3 引物 | 第95页 |
| 5.2.4 主要仪器与设备 | 第95-96页 |
| 5.2.5 培养基及培养条件 | 第96页 |
| 5.2.6 常用试剂 | 第96页 |
| 5.3 实验方法 | 第96-98页 |
| 5.3.1 蛋白在大烦巧菌中的异源表达及纯化 | 第96-97页 |
| 5.3.2 凝胶阻滞电泳 | 第97页 |
| 5.3.3 DNasel Footprinting | 第97-98页 |
| 5.3.4 基因患片分析 | 第98页 |
| 5.4 实验结栗 | 第98-110页 |
| 5.4.1 WhiG_(ch)序列分析 | 第98-99页 |
| 5.4.2 wWG_(ch)突变株的构建与验证 | 第99-101页 |
| 5.4.3 WhiC_(ch)对形态分化的影口向 | 第101页 |
| 5.4.4 WhiG_(ch)对纳他霉素产量的影响 | 第101-103页 |
| 5.4.5 ZJUL31菌株中巧/和内W/的转录水平分析 | 第103页 |
| 5.4.6 WhiG_(ch)直接结合到纳他霉素合成基因启动子区 | 第103-104页 |
| 5.4.7 WhiG_(ch)结合序列的确定 | 第104-105页 |
| 5.4.8 转录水平受影响的基因 | 第105-110页 |
| 5.5 本章小结与讨论 | 第110-113页 |
| 第六章 本文研究成果及展望 | 第113-115页 |
| 6.1 本文研究成果 | 第113页 |
| 6.2 展望 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-128页 |
| 附录 | 第128-129页 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130页 |
