| 致谢 | 第4-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| 1. 文献综述 | 第10-17页 |
| 1.1 猪β防御素的概况 | 第10-12页 |
| 1.1.1 猪β防御素的分类 | 第10-11页 |
| 1.1.2 猪β防御素的结构、表达与分布 | 第11页 |
| 1.1.3 猪β防御素的克隆表达 | 第11-12页 |
| 1.2 防御素的抗菌机理 | 第12-13页 |
| 1.3 差异表达基因的研究方法 | 第13-17页 |
| 1.3.1 传统差异表达基因的研究方法 | 第14页 |
| 1.3.2 mRNA差异显示技术及其他差异基因分析方法 | 第14-15页 |
| 1.3.3 ACPT~(TM)技术和GeneFishing~(TM) DEG Premix Kits | 第15-17页 |
| 2. 引言 | 第17-18页 |
| 3. 材料与方法 | 第18-36页 |
| 3.1 实验材料 | 第18-19页 |
| 3.1.1 引物合成、质粒和菌种 | 第18页 |
| 3.1.2 酶和试剂盒 | 第18页 |
| 3.1.3 培养基 | 第18页 |
| 3.1.4 主要试剂及配制 | 第18-19页 |
| 3.1.5 主要的仪器与设备 | 第19页 |
| 3.1.6 主要应用软件 | 第19页 |
| 3.2 实验方法 | 第19-36页 |
| 3.2.1 重组工程菌株pBD-2的诱导表达 | 第19-20页 |
| 3.2.2 重组目的蛋白的提取和纯化 | 第20-21页 |
| 3.2.2.1 试剂配制 | 第20-21页 |
| 3.2.2.2 目的蛋白的纯化 | 第21页 |
| 3.2.3 蛋白浓度的测定 | 第21页 |
| 3.2.4 SDS-PAGE电泳 | 第21-23页 |
| 3.2.4.1 相关溶液的配制 | 第21-22页 |
| 3.2.4.2 SDS-PAGE胶的制作 | 第22-23页 |
| 3.2.4.3 SDS-PAGE电泳 | 第23页 |
| 3.2.5 蛋白功能活性的分析 | 第23-24页 |
| 3.2.6 样本的采集和处理 | 第24页 |
| 3.2.7 细菌总RNA的提取、纯化和质量检测方法 | 第24-25页 |
| 3.2.7.1 大肠杆菌RNA提取 | 第24页 |
| 3.2.7.2 细菌总RNA浓度测定 | 第24页 |
| 3.2.7.3 各组细菌总RNA池的建立 | 第24页 |
| 3.2.7.4 细菌总RNA池的纯化 | 第24-25页 |
| 3.2.7.5 纯化后总RNA的浓度和质量检测 | 第25页 |
| 3.2.8 管家基因RT-PCR操作方法 | 第25-27页 |
| 3.2.8.1 管家基因引物设计方法 | 第25-26页 |
| 3.2.8.2 合成引物的稀释与处理方法 | 第26页 |
| 3.2.8.3 管家基因RT-PCR方法 | 第26-27页 |
| 3.2.9 GeneFishing~(TM)差异显示方法 | 第27-28页 |
| 3.2.9.1 GeneFishng~(TM)差异显示RT-PCR方法 | 第27-28页 |
| 3.2.9.2 GeneFishing产物的电泳检测 | 第28页 |
| 3.2.10 差异片段回收、克隆、测序方法 | 第28-30页 |
| 3.2.10.1 差异片段的回收 | 第28-29页 |
| 3.2.10.2 克隆载体的构建 | 第29页 |
| 3.2.10.3 感受态细胞的制备与转化 | 第29-30页 |
| 3.2.10.4 测序 | 第30页 |
| 3.2.11 差异表达基因序列分析 | 第30页 |
| 3.2.12 半定量RT-PCR二次验证方法 | 第30-33页 |
| 3.2.12.1 引物设计方法 | 第30-32页 |
| 3.2.12.2 半定量RT-PCR方法 | 第32-33页 |
| 3.2.12.3 半定量RT-PCR产物的电泳检测 | 第33页 |
| 3.2.13 荧光定量反转录PCR(FQRT-PCR)的试验方法 | 第33-36页 |
| 3.2.13.1 FQRT-PCR的试验步骤 | 第33-35页 |
| 3.2.13.2 FQRT-PCR结果分析方法 | 第35页 |
| 3.2.13.3 目的基因表达量的计算方法 | 第35页 |
| 3.2.13.4 数据分析方法 | 第35-36页 |
| 4. 结果与分析 | 第36-51页 |
| 4.1 目的蛋白的诱导表达及纯化 | 第36-37页 |
| 4.2 目的蛋白与大肠杆菌共培养生长趋势分析及抑菌活性分析 | 第37-38页 |
| 4.3 总RNA提取、纯化与检测结果 | 第38页 |
| 4.4 差异表达基因片段获得结果 | 第38-42页 |
| 4.4.1 第一链cDNA质量检测结果 | 第38-39页 |
| 4.4.2 GeneFishing~(TM)RT-PCR获得的差异显示片段结果 | 第39-42页 |
| 4.4.2.1 差异表达片段数目统计结果 | 第39页 |
| 4.4.2.2 GeneFishing~(TM)差异显示RT-PCR电泳结果 | 第39-42页 |
| 4.4.2.3 差异表达条带的回收、克隆和测序结果 | 第42页 |
| 4.5 差异表达基因片段在NCBI网站进行BLAST搜索结果 | 第42-44页 |
| 4.6 半定量RT-PCR验证结果 | 第44-46页 |
| 4.7 实时荧光定量RT-PCR验证结果 | 第46-51页 |
| 4.7.1 差异表达基因荧光定量数据结果 | 第46-47页 |
| 4.7.2 差异表达基因荧光定量数据作图分析结果 | 第47-51页 |
| 5. 结论与讨论 | 第51-58页 |
| 5.1 pBD-2的表达、纯化和抑菌 | 第51页 |
| 5.2 GeneFishing~(TM)RT-PCR反应 | 第51-52页 |
| 5.2.1 GeneFishing~(TM)RT-PCR基因差异表达研究方法 | 第51-52页 |
| 5.2.2 GeneFishing~(TM)RT-PCR差异表达结果 | 第52页 |
| 5.2.3 差异条带的回收、克隆和测序 | 第52页 |
| 5.3 半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR验证差异表达基因 | 第52-53页 |
| 5.4 获得的差异表达基因序列分析 | 第53-57页 |
| 5.5 小结 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| ABSTRACT | 第64-65页 |
| 附件 | 第66-68页 |
