| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 前言 | 第13-18页 |
| 缩略语表 | 第18-20页 |
| 第一部分 轮状病毒SA11株VP4在大肠杆菌中的表达纯化及免疫原性研究 | 第20-33页 |
| 一、试验材料与试验方法 | 第20-23页 |
| (一)、质粒及试剂 | 第20-21页 |
| (二)、试验方法 | 第21-23页 |
| 1、表达质粒的构建 | 第21页 |
| 2、VP4融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第21-22页 |
| 3、表达产物的纯化 | 第22页 |
| 4、表达产物的酶切 | 第22页 |
| 5、表达产物的免疫学分析 | 第22-23页 |
| (1) 蛋白印迹试验(Western Blot) | 第22-23页 |
| (2) 动物免疫试验 | 第23页 |
| (3) 中和试验 | 第23页 |
| 二、结果与分析 | 第23-29页 |
| (一)、VP4基因全序列克隆至融合表达载体pThioHisA | 第23-25页 |
| (二)、VP4融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第25-26页 |
| (三)、VP4融合蛋白的纯化 | 第26-27页 |
| (四)、VP4融合蛋白经3C蛋白酶酶切 | 第27-28页 |
| (五)、重组VP4免疫印迹 | 第28-29页 |
| (六)、重组VP4免疫血清的中和试验 | 第29页 |
| 三、讨论 | 第29-32页 |
| 四、小结 | 第32-33页 |
| 参考文献 | 第33页 |
| 第二部分 重组腺病毒表达轮状病毒抗原VP4的免疫原性研究 | 第33-79页 |
| 一、试验材料和方法 | 第33-45页 |
| (一)、试验材料 | 第33-34页 |
| (二) 试验方法 | 第34-45页 |
| 1、重组腺病毒的扩增及纯化 | 第34页 |
| 2、纯化重组腺病毒样品的滴度测定 | 第34-35页 |
| 3、纯化重组腺病毒样品中VP4基因的检测 | 第35页 |
| 4、重组腺病毒表达VP4的鉴定 | 第35-37页 |
| (1) 免疫印迹(Western blot) | 第35-36页 |
| (2) 免疫荧光(immunofluorescence) | 第36页 |
| (3) 电镜(electromicroscope) | 第36-37页 |
| 5、重组腺病毒免疫小鼠 | 第37-39页 |
| (1) 免疫前的准备 | 第37-38页 |
| (2) 免疫时间图 | 第38页 |
| (3) 免疫剂量表 | 第38-39页 |
| (4) 血清及粪便采集样品的处理 | 第39页 |
| 6、酶联免疫吸附试验检测轮状病毒VP4特异抗体 | 第39-42页 |
| (1) 轮状病毒SA11的制备 | 第39-40页 |
| (2) 预试验 | 第40-41页 |
| (3) 二抗及OPD溶液浓度测定 | 第41页 |
| (4) ELISA体系特异性检测 | 第41-42页 |
| 7、免疫血清及肠黏液中抗体的中和试验和免疫酶检测 | 第42-43页 |
| (1) 中和试验 | 第42-43页 |
| (2) 免疫组化 | 第43页 |
| 8、小鼠脾细胞中γ干扰素检测 | 第43-44页 |
| (1) 小鼠脾脏细胞的分离和培养 | 第43-44页 |
| (2) γ干扰素检测 | 第44页 |
| 9、被动保护试验 | 第44-45页 |
| (1) 免疫方案 | 第44-45页 |
| (2) Balb／c成年鼠血清及乳汁的SA11特异性抗体ELISA检测 | 第45页 |
| 二、结果与分析 | 第45-68页 |
| (一)、重组腺病毒的扩增及纯化 | 第45-47页 |
| (二)、纯化重组腺病毒样品滴度测定 | 第47页 |
| 1、293细胞计数 | 第47页 |
| 2、有限稀释法计算重组腺病毒滴度 | 第47页 |
| (三)、纯化腺病毒样品中VP4基因的检测 | 第47-48页 |
| (四)、重组腺病毒表达VP4的鉴定 | 第48-53页 |
| 1、免疫印迹(Western blot) | 第48-50页 |
| 2、免疫荧光(immunoflurescence) | 第50-53页 |
| 3、电镜(electromicroscop) | 第53页 |
| (五)、重组腺病毒免疫小鼠 | 第53-54页 |
| (六)、酶联免疫吸附试验检测轮状病毒VP4特异抗体 | 第54-62页 |
| (七)、免疫血清及肠黏液中抗体的中和试验及免疫组化检测 | 第62-65页 |
| (八)、小鼠脾脏细胞中轮状病毒特异的γ干扰素检测 | 第65-66页 |
| (九)、被动保护试验 | 第66-68页 |
| 三、讨论 | 第68-76页 |
| 四、小结 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-79页 |
| 第三部分 构建轮状病毒SA11株非结构蛋白NSP4分泌型毕赤酵母表达载体 | 第79-87页 |
| 一、材料和方法 | 第81-82页 |
| (一)、NSP4基因的克隆 | 第81-82页 |
| (二)、NSP4基因重组至毕赤酵母表达载体pPIC9k | 第82页 |
| 二、试验结果和分析 | 第82-85页 |
| (一)、RT-PCR克隆NSP4基因 | 第82页 |
| (二)、重组质粒pPIC9K／NSP4的构建 | 第82-83页 |
| (三)、阳性克隆的序列测定及分析 | 第83-85页 |
| 三、讨论 | 第85页 |
| 参考文献 | 第85-87页 |
| 综述 | 第87-110页 |
| 一、轮状病毒研究进展 | 第87-103页 |
| 二、腺病毒载体的发展与应用 | 第103-110页 |
| 附录 | 第110-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
| 简历 | 第123-125页 |
