| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 符号说明 | 第8-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一部分 TNF-α与脊柱结核破骨细胞形成的相关性研究 | 第13-32页 |
| 材料和方法 | 第13-21页 |
| 1. 实验材料 | 第13-14页 |
| 1.1 细胞株 | 第13页 |
| 1.2 主要试剂 | 第13-14页 |
| 1.3 主要仪器 | 第14页 |
| 1.4 主要液体的配制 | 第14页 |
| 2. 实验方法 | 第14-21页 |
| 2.1 细胞操作实验方法 | 第14-15页 |
| 2.1.1 无菌操作注意事项 | 第14页 |
| 2.1.2 细胞复苏 | 第14-15页 |
| 2.1.3 细胞换液 | 第15页 |
| 2.1.4 细胞传代 | 第15页 |
| 2.1.5 细胞冻存 | 第15页 |
| 2.1.6 PPD诱导培养RAW264.7 细胞 | 第15页 |
| 2.2 细胞增殖与毒性试验 | 第15-16页 |
| 2.3 TRAP染色 | 第16页 |
| 2.4 PPD剂量对破骨细胞形成的影响 | 第16页 |
| 2.5 PPD诱导时间对破骨细胞形成的影响 | 第16-17页 |
| 2.6 qPCR检测不同诱导时间TNF-α基因的表达 | 第17-19页 |
| 2.6.1 引物设计 | 第17页 |
| 2.6.2 总RNA的提取 | 第17-18页 |
| 2.6.3 反转录步骤 | 第18页 |
| 2.6.4 qPCR反应体系与条件 | 第18-19页 |
| 2.6.5 TNF-α基因相对表达量的计算方法 | 第19页 |
| 2.7 Western Blotting检测TNF-α蛋白的表达 | 第19-21页 |
| 2.7.1 细胞全蛋白的提取及定量 | 第19-20页 |
| 2.7.2 SDS-PAGE电泳 | 第20页 |
| 2.7.3 TNF-α蛋白相对表达量的计算方法 | 第20-21页 |
| 2.8 统计分析 | 第21页 |
| 结果 | 第21-28页 |
| 1.PPD剂量对RAW264.7 细胞存活率的影响 | 第21页 |
| 2.RAW264.7 细胞在PPD诱导后的形态学变化特点 | 第21-22页 |
| 3.PPD诱导RAW264.7 细胞分化为破骨细胞 | 第22-23页 |
| 4.不同剂量PPD诱导破骨细胞形成的数量差异 | 第23页 |
| 5.PPD诱导不同时间破骨细胞形成的差异 | 第23-24页 |
| 6.qPCR实验结果 | 第24-25页 |
| 6.1 PPD诱导不同时间TNF-α基因相对表达量 | 第24-25页 |
| 6.2 扩增/溶解曲线 | 第25页 |
| 7.Western Blotting实验结果 | 第25-27页 |
| 7.1 标准曲线及样本浓度 | 第25-26页 |
| 7.2 WB结果 | 第26-27页 |
| 7.2.1 PPD诱导不同时间的TNF-α蛋白和内参条带 | 第26页 |
| 7.2.2 PPD诱导不同时间TNF-α蛋白的表达情况 | 第26-27页 |
| 8.TNF-α与破骨细胞之间的相关关系 | 第27-28页 |
| 8.1 TNF-α基因与破骨细胞数之间的相关关系 | 第27页 |
| 8.2 TNF-α蛋白与破骨细胞之间的相关关系 | 第27-28页 |
| 讨论 | 第28-32页 |
| 第二部分 TNF-α 基因shRNA的构建及其抑制脊柱结核破骨细胞形成的实验研究 | 第32-49页 |
| 材料和方法 | 第32-40页 |
| 1.实验材料 | 第32-33页 |
| 1.1 主要试剂 | 第32页 |
| 1.2 主要仪器 | 第32页 |
| 1.3 主要液体的配制 | 第32-33页 |
| 2.实验方法 | 第33-40页 |
| 2.1 靶向TNF-α基因shRNA表达载体的构建 | 第33-35页 |
| 2.1.1 目的基因获取 | 第33页 |
| 2.1.2 双酶切反应 | 第33-34页 |
| 2.1.3 胶回收 | 第34页 |
| 2.1.4 连接与转化 | 第34-35页 |
| 2.2 TNF-α-shRNA质粒转染小鼠RAW264.7 细胞 | 第35页 |
| 2.3 RT-PCR检测转染后不同时间点TNF-α基因的表达情况 | 第35-37页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第35页 |
| 2.3.2 实验步骤 | 第35-37页 |
| 2.4 qPCR测定TNF-α及RANK m RNA基因表达情况 | 第37-39页 |
| 2.4.1 实验分组 | 第37页 |
| 2.4.2 引物设计 | 第37-38页 |
| 2.4.3 总RNA的提取 | 第38页 |
| 2.4.4 qPCR的操作步骤 | 第38-39页 |
| 2.4.5 目的基因相对表达量的计算方法 | 第39页 |
| 2.5 Western Blotting测定TNF-α蛋白的表达情况 | 第39-40页 |
| 2.5.1 实验分组 | 第39页 |
| 2.5.2 细胞裂解 | 第39页 |
| 2.5.3 BSA标准曲线的制作 | 第39-40页 |
| 2.5.4 样品测定 | 第40页 |
| 2.5.5 SDS－PAGE电泳 | 第40页 |
| 2.5.6 TNF-α蛋白相对表达量的计算方法 | 第40页 |
| 2.6 TRAP染色比较各样本破骨细胞数量之间的差异 | 第40页 |
| 2.6.1 实验分组 | 第40页 |
| 2.6.2 TRAP染色方法 | 第40页 |
| 2.6.3 计数方法 | 第40页 |
| 2.7 统计分析 | 第40页 |
| 结果 | 第40-46页 |
| 1.靶向TNF-α基因shRNA表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.TNF-α-shRNA质粒转染小鼠RAW264.7 细胞 | 第41页 |
| 3.TNF-α- shRNA转染后不同时间点TNF-α基因的表达情况 | 第41页 |
| 4.qPCR实验结果 | 第41-43页 |
| 4.1 不同样本转染前后TNF-α基因的相对表达量差异 | 第41-42页 |
| 4.2 不同样本转染前后RANK基因相对表达量的差异 | 第42-43页 |
| 4.3 扩增/溶解曲线 | 第43页 |
| 5.Western Blotting实验结果 | 第43-45页 |
| 5.1 标准曲线及样品浓度 | 第43-44页 |
| 5.1.1 标准曲线 | 第43-44页 |
| 5.1.2 样本浓度 | 第44页 |
| 5.2 蛋白条带 | 第44页 |
| 5.3 不同样本转染前后TNF-α蛋白表达量的差异 | 第44-45页 |
| 6.不同样本破骨细胞间的数量差异 | 第45-46页 |
| 讨论 | 第46-49页 |
| 总结 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-55页 |
| 综述 | 第55-69页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第70页 |
