| 摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 文章综述 | 第12-19页 |
| 1 产气荚膜梭菌的简介 | 第12-13页 |
| 2 仔猪A型产气荚膜梭菌的流行及危害 | 第13-14页 |
| 3 产气荚膜梭菌β_2 毒素研究进展 | 第14-15页 |
| 3.1 β_2 毒素的分子结构特征 | 第14页 |
| 3.2 β_2 毒素的作用机制 | 第14-15页 |
| 3.3 感染β_2 毒素后哺乳仔猪肠道的病理变化特点 | 第15页 |
| 4 产气荚膜梭菌的鉴定和分型 | 第15-16页 |
| 5 仔猪肠道菌群的发育及参与肠道屏障的功能 | 第16-17页 |
| 5.1 仔猪肠道菌群的发育 | 第16页 |
| 5.2 仔猪肠道菌群参与肠道屏障的功能 | 第16-17页 |
| 6 DGGE和高通量测序技术在动物肠道菌群微生物群落中的应用 | 第17页 |
| 7 抗生素的危害及益生菌的功能 | 第17-18页 |
| 8 本研究目的与意义 | 第18-19页 |
| 第二章 哺乳仔猪Cp分离鉴定及α、β_2 毒素基因双重PCR检测方法的建立与应用 | 第19-28页 |
| 1 材料与方法 | 第19-22页 |
| 1.1 菌株和载体 | 第19页 |
| 1.2 主要实验仪器和试剂 | 第19-20页 |
| 1.2.1 主要实验仪器 | 第19-20页 |
| 1.2.2 主要实验试剂 | 第20页 |
| 1.3 样品采集 | 第20页 |
| 1.4 样品处理 | 第20页 |
| 1.5 细菌分离与生化试验 | 第20-21页 |
| 1.5.1 4%环丝氨酸的配制 | 第20页 |
| 1.5.2 细菌的选择性分离培养 | 第20页 |
| 1.5.3 牛乳发酵试验 | 第20-21页 |
| 1.5.4 生化试验 | 第21页 |
| 1.6 PCR检测方法的建立 | 第21-22页 |
| 1.6.1 模板的制备 | 第21页 |
| 1.6.2 引物设计 | 第21页 |
| 1.6.3 PCR反应 | 第21-22页 |
| 1.6.4 目的产物纯化、连接与转化 | 第22页 |
| 1.6.5 重组质粒测序鉴定 | 第22页 |
| 1.6.6 PCR的条件优化 | 第22页 |
| 1.7 临床检测 | 第22页 |
| 2 结果 | 第22-26页 |
| 2.1 细菌分离 | 第22-23页 |
| 2.2 牛乳发酵和生化试验 | 第23-24页 |
| 2.3 江西地区产气荚膜梭菌分离情况和分离率差异显著性分析 | 第24页 |
| 2.4 双重PCR检测方法的建立 | 第24-25页 |
| 2.4.1 特异性实验 | 第24-25页 |
| 2.4.2 敏感性实验 | 第25页 |
| 2.5 目的片段的序列分析 | 第25-26页 |
| 2.6 临床样品的检测 | 第26页 |
| 3 分析与讨论 | 第26-28页 |
| 3.1 产气荚膜梭菌的分离 | 第26-27页 |
| 3.2 产气荚膜梭菌α、β_2 毒素基因PCR检测方法的建立 | 第27页 |
| 3.3 临床样品的检测 | 第27-28页 |
| 第三章 多重PCR检测哺乳仔猪CpA方法的建立与应用 | 第28-35页 |
| 1 方法 | 第28-30页 |
| 1.1 标准菌株 | 第28页 |
| 1.2 样品的采集和处理 | 第28页 |
| 1.3 PCR检测方法的建立 | 第28-30页 |
| 1.3.1 细菌的选择性培养及模板的制备 | 第28-29页 |
| 1.3.2 引物设计 | 第29页 |
| 1.3.3 PCR反应 | 第29页 |
| 1.3.4 目的产物纯化、连接与转化 | 第29-30页 |
| 1.3.5 重组质粒测序鉴定 | 第30页 |
| 1.3.6 PCR的条件优化 | 第30页 |
| 1.4 临床检测 | 第30页 |
| 2 结果 | 第30-32页 |
| 2.1 多重PCR特异性实验 | 第30-31页 |
| 2.2 多重PCR敏感性实验 | 第31-32页 |
| 2.3 目的片段的序列分析 | 第32页 |
| 2.4 临床样品的检测 | 第32页 |
| 3 分析与讨论 | 第32-35页 |
| 3.1 多重PCR检测方法的建立 | 第32-33页 |
| 3.2 样品的检测 | 第33-35页 |
| 第四章 健康与腹泻哺乳仔猪肠道菌群差异性比较 | 第35-44页 |
| 1 材料和方法 | 第35-37页 |
| 1.1 材料 | 第35页 |
| 1.1.1 样品准备 | 第35页 |
| 1.1.2 试验仪器 | 第35页 |
| 1.2 试验方法 | 第35-37页 |
| 1.2.1 粪样细菌总DNA提取 | 第35页 |
| 1.2.2 肠道总细菌 16SrDNA V3区PCR扩增 | 第35-36页 |
| 1.2.3 DGGE及图谱分析 | 第36-37页 |
| 1.2.4 高通量测序分析 | 第37页 |
| 2 结果与分析 | 第37-41页 |
| 2.1 PCR结果 | 第37-38页 |
| 2.2 DGGE电泳指纹图谱 | 第38页 |
| 2.3 高通量测序结果生物学信息分析 | 第38-41页 |
| 2.3.1 样品多样性指数（Alpha-diversity）分析 | 第38-40页 |
| 2.3.2 OTU比较venn图 | 第40页 |
| 2.3.3 细菌门水平群落结构组分图 | 第40-41页 |
| 2.3.4 细菌属水平群落结构组分图 | 第41页 |
| 3 分析与讨论 | 第41-44页 |
| 3.1 PCR扩增 | 第41-42页 |
| 3.2 DGGE电泳 | 第42页 |
| 3.3 高通量测序结果生物学信息分析 | 第42-44页 |
| 3.3.1 样品多样性指数（Alpha-diversity）分析 | 第42页 |
| 3.3.2 细菌门、属水平群落结构的分析 | 第42-44页 |
| 第五章 拮抗CpA的哺乳仔猪源乳酸杆菌的筛选与鉴定 | 第44-53页 |
| 1 试验方法 | 第44-47页 |
| 1.1 菌株分离 | 第44页 |
| 1.2 具有拮抗CpA菌的菌株初筛 | 第44页 |
| 1.3 乳酸杆菌属的生化鉴定 | 第44页 |
| 1.4 具有拮抗CpA菌的乳酸杆菌复筛 | 第44-45页 |
| 1.5 复筛后乳酸杆菌抗逆性试验 | 第45页 |
| 1.5.1 菌株的耐酸性试验 | 第45页 |
| 1.5.2 菌株的耐胆盐试验 | 第45页 |
| 1.5.3 菌株的耐蛋白酶试验 | 第45页 |
| 1.6 乳酸杆菌种的生化和 16SrDNA分子鉴定 | 第45-47页 |
| 2 结果 | 第47-51页 |
| 2.1 乳酸杆菌的分离 | 第47-48页 |
| 2.2 乳酸杆菌的初筛 | 第48页 |
| 2.3 乳酸杆菌属的生化鉴定 | 第48页 |
| 2.4 具有拮抗CpA菌的乳酸杆菌复筛 | 第48-49页 |
| 2.5 乳酸杆菌的耐酸性试验 | 第49-50页 |
| 2.6 乳酸杆菌的耐胆盐试验 | 第50页 |
| 2.7 乳酸杆菌的耐蛋白酶试验 | 第50-51页 |
| 2.8 乳酸杆菌种的鉴定 | 第51页 |
| 2.8.1 乳酸杆菌种的生化鉴定结果 | 第51页 |
| 2.8.2 16SrRNA鉴定的测序结果分析 | 第51页 |
| 3 分析与讨论 | 第51-53页 |
| 3.1 乳酸杆菌的分离与筛选 | 第51页 |
| 3.2 乳酸杆菌的抗逆性试验 | 第51-53页 |
| 第六章 多种饲料添加剂类抗生素对CpA的抑菌效果研究 | 第53-57页 |
| 1 材料和方法 | 第53-54页 |
| 1.1 试验材料 | 第53-54页 |
| 1.1.1 试验菌株 | 第53页 |
| 1.1.2 培养基 | 第53页 |
| 1.1.3 试验药物 | 第53-54页 |
| 1.2 试验方法 | 第54页 |
| 1.2.1 试验药物的处理 | 第54页 |
| 1.2.2 A型产气荚膜梭菌的准备 | 第54页 |
| 1.2.3 采用试管稀释法测定七种药物的最低抑菌浓度 | 第54页 |
| 2 结果 | 第54-55页 |
| 2.1 恩拉霉素对A型产气夹膜梭菌的抑菌试验结果 | 第54-55页 |
| 2.2 七种药物对A型产气荚膜梭菌的抑菌结果 | 第55页 |
| 3 分析与讨论 | 第55-57页 |
| 第七章 A型产气荚膜梭菌β_2 毒素基因的克隆与表达 | 第57-63页 |
| 1 试验材料与方法 | 第57-59页 |
| 1.1 材料 | 第57页 |
| 1.2 PCR扩增β_2 毒素基因 | 第57-58页 |
| 1.2.1 CpA的DNA提取 | 第57页 |
| 1.2.2 β_2 毒素基因表达引物的设计 | 第57页 |
| 1.2.3 PCR反应 | 第57-58页 |
| 1.2.4 目的产物纯化、PMD18-T-CpB2重组质粒构建与转化 | 第58页 |
| 1.3 pET-32a- CpB2表达载体的构建 | 第58页 |
| 1.3.1 PMD18-T-CpB2重组质粒与表达载体pET-32a双酶切反应 | 第58页 |
| 1.3.2 转化试验 | 第58页 |
| 1.3.3 pET-32a- CpB2表达载体的测序鉴定 | 第58页 |
| 1.4 IPTG诱导目的蛋白表达 | 第58-59页 |
| 1.5 IPTG诱导目的蛋白高效表达条件的优化 | 第59页 |
| 2 结果 | 第59-62页 |
| 2.1 β_2 毒素基因的扩增与测序分析 | 第59页 |
| 2.2 pET-32a- CpB2表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 2.3 IPTG诱导重组β_2 毒素蛋白表达及高效表达条件的优化 | 第60-62页 |
| 2.3.1 IPTG诱导重组β_2 毒素蛋白表达 | 第60页 |
| 2.3.2 不同IPTG浓度对重组β_2 毒素蛋白表达影响 | 第60-61页 |
| 2.3.3 不同诱导时间对重组β_2 毒素蛋白表达影响 | 第61-62页 |
| 3 讨论与分析 | 第62-63页 |
| 全文总结 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 附录 | 第73-75页 |
