| 摘要 | 第3-7页 |
| Abstract | 第7-11页 |
| 1 引言 | 第23-80页 |
| 1.1 逆转录病毒 | 第23-31页 |
| 1.1.1 逆转录病毒基因组和基因产物 | 第24-26页 |
| 1.1.2 逆转录病毒生活史 | 第26-31页 |
| 1.2 外源性和内源性逆转录病毒的分类 | 第31-33页 |
| 1.3 外源性逆转录病毒 | 第33-34页 |
| 1.4 外源性绵羊肺腺瘤病毒 | 第34-41页 |
| 1.4.1 绵羊肺腺瘤病的概述 | 第36-37页 |
| 1.4.2 绵羊肺腺瘤病的发病机理 | 第37-41页 |
| 1.5 内源性逆转录病毒 | 第41-53页 |
| 1.5.1 内源性逆转录病毒的形成和灭亡 | 第42-44页 |
| 1.5.2 内源性逆转录病毒在宿主中的作用 | 第44页 |
| 1.5.3 内源性逆转录病毒囊膜蛋白与哺乳动物胎盘 | 第44-48页 |
| 1.5.4 内源性逆转录病毒囊膜蛋白在胎盘中可能的作用 | 第48-53页 |
| 1.6 内源性绵羊肺腺瘤病毒 | 第53-64页 |
| 1.6.1 内源性绵羊肺腺瘤病毒的表达模式 | 第54-55页 |
| 1.6.2 内源性绵羊肺腺瘤病毒抵抗外源性绵羊肺腺瘤病毒的感染 | 第55-60页 |
| 1.6.3 内源性绵羊肺腺瘤病毒与宿主共进化 | 第60-62页 |
| 1.6.4 内源性绵羊肺腺瘤病毒与绵羊胎盘的形成 | 第62-64页 |
| 1.7 细胞永生化 | 第64-69页 |
| 1.7.1 端粒和端粒酶 | 第66-67页 |
| 1.7.2 端粒酶与细胞永生化 | 第67-68页 |
| 1.7.3 滋养层细胞永生化 | 第68-69页 |
| 1.8 细菌人工染色体基因组文库概述 | 第69-78页 |
| 1.8.1 BAC文库的构建 | 第71-73页 |
| 1.8.2 外源性绵羊肺腺瘤病毒与绵羊基因组文库 | 第73-75页 |
| 1.8.3 内源性绵羊肺腺瘤病毒与绵羊基因组文库 | 第75-78页 |
| 1.9 研究的目的及意义 | 第78-80页 |
| 2 试验一 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞系的建立 | 第80-110页 |
| 2.1 材料 | 第81-84页 |
| 2.1.1 试验动物及主要试剂 | 第81-82页 |
| 2.1.2 试验所用溶液及其配制 | 第82-84页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第84页 |
| 2.1.4 质粒和细胞系 | 第84页 |
| 2.2 方法 | 第84-96页 |
| 2.2.1 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的分离及培养 | 第84-85页 |
| 2.2.2 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的鉴定 | 第85-86页 |
| 2.2.3 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞电转染条件的测定 | 第86-87页 |
| 2.2.4 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞耐受新霉素(G418)的最低浓度 | 第87页 |
| 2.2.5 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的永生化 | 第87-89页 |
| 2.2.6 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的基因表达模式 | 第89-92页 |
| 2.2.7 永生化的绵羊胎盘滋养层细胞的生物学特性分析 | 第92-95页 |
| 2.2.8 永生化的绵羊胎盘滋养层细胞转化特征的检测 | 第95页 |
| 2.2.9 统计学分析 | 第95-96页 |
| 2.3 结果 | 第96-108页 |
| 2.3.1 酶消化法分离的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞 | 第96页 |
| 2.3.2 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的最佳电转染条件 | 第96-98页 |
| 2.3.3 新霉素(G418)的最佳筛选浓度 | 第98页 |
| 2.3.4 阳性细胞克隆群的扩大培养 | 第98-99页 |
| 2.3.5 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞形态学特点 | 第99-100页 |
| 2.3.6 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞鉴定结果 | 第100-101页 |
| 2.3.7 hTERT基因在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中稳定表达 | 第101-102页 |
| 2.3.8 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的生长特性 | 第102-103页 |
| 2.3.9 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞可以分泌激素 | 第103-105页 |
| 2.3.10 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞可以表达enJSRV-env基因 | 第105页 |
| 2.3.11 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞具有侵袭性 | 第105-106页 |
| 2.3.12 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞没有发生转化 | 第106-108页 |
| 2.4 讨论 | 第108-110页 |
| 3 实验二 enJSRV-env基因的克隆、真核表达质粒的构建及其shRNA真核表达质粒的构建 | 第110-138页 |
| 3.1 材料 | 第111-114页 |
| 3.1.1 试验动物及主要试剂 | 第111页 |
| 3.1.2 试验所用溶液及其配制 | 第111-113页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第113页 |
| 3.1.4 质粒和细胞系 | 第113-114页 |
| 3.2 方法 | 第114-128页 |
| 3.2.1 引物设计与合成 | 第114页 |
| 3.2.2 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养 | 第114页 |
| 3.2.3 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞总RNA的提取 | 第114-115页 |
| 3.2.4 目的基因的扩增 | 第115-117页 |
| 3.2.5 enJSRV-env基因的序列分析 | 第117页 |
| 3.2.6 真核表达质粒的构建及鉴定 | 第117-123页 |
| 3.2.7 enJSRV-env shRNA设计及合成 | 第123页 |
| 3.2.8 enJSRV-env基因的shRNA真核表达载体的构建 | 第123-125页 |
| 3.2.9 enJSRV-env基因沉默效果评价 | 第125-128页 |
| 3.2.10 数据处理 | 第128页 |
| 3.3 结果 | 第128-135页 |
| 3.3.1 enJSRV-env基因的扩增 | 第128页 |
| 3.3.2 Hyal2基因的扩增 | 第128-129页 |
| 3.3.3 enJSRV-env基因的序列分析 | 第129-131页 |
| 3.3.4 pEGFP-C1/enJSRV-env真核表达质粒的酶切鉴定 | 第131-132页 |
| 3.3.5 pEGFP-C1/Hyal2真核表达质粒的酶切鉴定 | 第132-133页 |
| 3.3.6 重组干扰质粒酶切鉴定 | 第133页 |
| 3.3.7 荧光定量PCR检测enJSRV-env基因沉默效果 | 第133-135页 |
| 3.4 讨论 | 第135-138页 |
| 4 实验三 enJSRV ENV参与绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的融合及侵袭 | 第138-157页 |
| 4.1 材料 | 第139-141页 |
| 4.1.1 试验动物及主要试剂 | 第139页 |
| 4.1.2 试验所用溶液及其配制 | 第139-141页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第141页 |
| 4.1.4 质粒和细胞系 | 第141页 |
| 4.2 方法 | 第141-145页 |
| 4.2.1 绵羊胎盘组织HE染色 | 第141页 |
| 4.2.2 免疫组织化学染色 | 第141-142页 |
| 4.2.3 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞培养 | 第142页 |
| 4.2.4 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞转染 | 第142页 |
| 4.2.5 pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中瞬时表达 | 第142-143页 |
| 4.2.6 enJSRV囊膜蛋白氨基酸序列分析 | 第143页 |
| 4.2.7 enJSRV-env及其受体Hyal2对绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞融合作用的影响 | 第143-144页 |
| 4.2.8 enJSRV-env对绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞侵袭作用的影响 | 第144页 |
| 4.2.9 enJSRV-env对绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞激素分泌量的影响 | 第144页 |
| 4.2.10 数据处理 | 第144-145页 |
| 4.3 结果 | 第145-154页 |
| 4.3.1 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞大量表达enJSRV-env | 第145-146页 |
| 4.3.2 enJSRV囊膜蛋白氨基酸序列分析 | 第146-148页 |
| 4.3.3 enJSRV-env及Hyal2在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中瞬时表达 | 第148-149页 |
| 4.3.4 enJSRV-env可以促进绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞融合 | 第149-151页 |
| 4.3.5 enJSRV囊膜蛋白可以改变绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞侵袭性 | 第151-153页 |
| 4.3.6 enJSRV-env不影响绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的激素分泌量 | 第153-154页 |
| 4.4 讨论 | 第154-157页 |
| 5 实验四 enJSRV囊膜蛋白与JSRV囊膜蛋白结构和功能的对比研究 | 第157-181页 |
| 5.1 材料 | 第158-160页 |
| 5.1.1 试验动物及主要试剂 | 第158页 |
| 5.1.2 试验所用溶液及其配制 | 第158-159页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第159页 |
| 5.1.4 质粒和细胞系 | 第159-160页 |
| 5.2 方法 | 第160-167页 |
| 5.2.1 总RNA的提取与处理 | 第160页 |
| 5.2.2 引物设计 | 第160-161页 |
| 5.2.3 目的基因的扩增 | 第161页 |
| 5.2.4 pEGFP-C1/exJSRV-env真核表达质粒的构建及鉴定 | 第161-164页 |
| 5.2.5 pEGFP-C1/exJSRV-env在293T细胞中表达并亚细胞定位 | 第164-165页 |
| 5.2.6 exJSRV-env与enJSRV-env基因的生物信息学分析 | 第165-166页 |
| 5.2.7 转化NIH3T3细胞 | 第166页 |
| 5.2.8 软琼脂集落形成实验 | 第166页 |
| 5.2.9 裸鼠致瘤实验 | 第166-167页 |
| 5.3 结果 | 第167-178页 |
| 5.3.1 exJSRV-env基因的扩增 | 第167页 |
| 5.3.2 真核表达质粒pEGFP-C1/exJSRV-env的构建与鉴定 | 第167-168页 |
| 5.3.3 exJSRV-env在293 T细胞中的亚细胞定位 | 第168-169页 |
| 5.3.4 exJSRV-env基因与enJSRV-env基因的生物信息学分析 | 第169-176页 |
| 5.3.5 转化NIH3T3细胞 | 第176-177页 |
| 5.3.6 软琼脂集落形成实验 | 第177页 |
| 5.3.7 裸鼠致瘤实验 | 第177-178页 |
| 5.4 讨论 | 第178-181页 |
| 6 试验五 OPA病羊肺组织基因组BAC文库的构建、鉴定及筛选 | 第181-214页 |
| 6.1 材料 | 第182-185页 |
| 6.1.1 试验动物及主要试剂 | 第182页 |
| 6.1.2 试验所用溶液及其配制 | 第182-184页 |
| 6.1.3 主要仪器 | 第184页 |
| 6.1.4 菌株以及载体 | 第184-185页 |
| 6.2 方法 | 第185-197页 |
| 6.2.1 文库构建 | 第185-189页 |
| 6.2.2 文库的鉴定 | 第189-191页 |
| 6.2.3 文库的筛选 | 第191-197页 |
| 6.3 结果 | 第197-211页 |
| 6.3.1 基因组DNA的不完全酶切 | 第197-198页 |
| 6.3.2 DNA片段的选择及回收 | 第198页 |
| 6.3.3 文库的保存 | 第198-199页 |
| 6.3.4 BAC文库的评价 | 第199-201页 |
| 6.3.5 BAC质粒末端测序 | 第201-202页 |
| 6.3.6 PCR筛选BAC文库 | 第202-206页 |
| 6.3.7 JSRV相关的内源性逆转录病毒基因阳性克隆的获得 | 第206-211页 |
| 6.4 讨论 | 第211-214页 |
| 7 总体结论与创新点 | 第214-216页 |
| 7.1 总体结论 | 第214页 |
| 7.2 创新点 | 第214-216页 |
| 致谢 | 第216-218页 |
| 参考文献 | 第218-248页 |
| 作者简介 | 第248-249页 |
