| 致谢 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-43页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第12-17页 |
| ·大肠杆菌表达载体 | 第12-16页 |
| ·目的蛋白在大肠杆菌中的表达形式 | 第16页 |
| ·大肠杆菌表达系统的发展趋势 | 第16-17页 |
| ·酵母表达系统 | 第17-22页 |
| ·酵母载体的基本结构 | 第17-19页 |
| ·酵母基因表达系统的宿主 | 第19-20页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第20-22页 |
| ·酵母表达系统研究的发展趋势 | 第22页 |
| ·纤维小体系统 | 第22-23页 |
| ·纤维小体的简介 | 第22页 |
| ·纤维小体基本结构 | 第22-23页 |
| ·蛋白质相互作用 | 第23-25页 |
| ·蛋白质作用界面的大小 | 第23-24页 |
| ·蛋白质作用界面的形状 | 第24页 |
| ·蛋白质作用界面的互补性 | 第24页 |
| ·蛋白质作用界面的疏水性和氢键 | 第24页 |
| ·蛋白质复合物的结合力 | 第24页 |
| ·界面残基的倾向性 | 第24-25页 |
| ·蛋白质复合物形成时构象的变化 | 第25页 |
| ·酵母细胞表面展示 | 第25-30页 |
| ·酵母细胞壁的组成 | 第25-26页 |
| ·酵母细胞壁蛋白的锚定方式 | 第26页 |
| ·GPI锚定蛋白 | 第26-27页 |
| ·GPI锚定蛋白的生物合成 | 第27-28页 |
| ·GPI锚定蛋白的去向 | 第28-29页 |
| ·Pir型锚定蛋白 | 第29页 |
| ·酵母表面展示的应用研究 | 第29-30页 |
| ·烟酰胺腺嘌呤辅酶 | 第30-31页 |
| ·本课题的研究内容与意义 | 第31页 |
| ·本课题的创新点 | 第31-32页 |
| 参考文献 | 第32-43页 |
| 第二章 甲酸脱氢酶的表达 | 第43-61页 |
| 引言 | 第43-44页 |
| ·实验材料和仪器 | 第44-47页 |
| ·菌株与质粒 | 第44页 |
| ·主要试剂 | 第44-45页 |
| ·主要仪器 | 第45页 |
| ·培养基与溶液 | 第45-47页 |
| ·实验方法 | 第47-55页 |
| ·目的基因的全合成 | 第47-48页 |
| ·目的基因的克隆 | 第48-49页 |
| ·pET-20b-Cbfdh-Ccdoc重组质粒的构建 | 第49-52页 |
| ·CbFDH-Ccdockerin的诱导表达 | 第52页 |
| ·目的蛋白的分离纯化 | 第52-53页 |
| ·目的蛋白SDS-PAGE分析 | 第53-54页 |
| ·蛋白质浓度测定方法 | 第54页 |
| ·重组CbFDH-Ccdockerin的酶活测定 | 第54-55页 |
| ·结果与讨论 | 第55-58页 |
| ·Cbfdh编码序列的密码子优化和表达 | 第55-57页 |
| ·CbFDH-Ccdockerin融合酶的比酶活测定 | 第57-58页 |
| 本章小结 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-61页 |
| 第三章 细胞色素单加氧酶P450_(BM-3)辅酶特异性改造 | 第61-74页 |
| 引言 | 第61-62页 |
| ·实验材料和仪器 | 第62-63页 |
| ·菌株和质粒 | 第62页 |
| ·主要试剂 | 第62-63页 |
| ·实验方法 | 第63-66页 |
| ·突变位点的确定 | 第63页 |
| ·突变体的构建 | 第63-66页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第66页 |
| ·突变体蛋白的分离纯化 | 第66页 |
| ·P450_(BM-3)单加氧酶酶活测定 | 第66页 |
| ·结果与讨论 | 第66-71页 |
| ·结构信息的获取 | 第66-67页 |
| ·突变位点的选择 | 第67-68页 |
| ·突变体的确定 | 第68页 |
| ·突变体的DNA测序 | 第68页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第68-69页 |
| ·突变体酶活的测定 | 第69-71页 |
| 本章小结 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-74页 |
| 第四章 迷你脚手架蛋白和DOCKERIN之间的相互作用 | 第74-90页 |
| 引言 | 第74页 |
| ·实验材料和仪器 | 第74-76页 |
| ·菌株与质粒 | 第74-75页 |
| ·主要试剂 | 第75-76页 |
| ·实验方法 | 第76-80页 |
| ·迷你脚手架蛋白编码DNA的拼接和全基因合成 | 第76页 |
| ·mixa3基因亚克隆 | 第76-77页 |
| ·pTrc99a-mixa3和pET-20b-mixa3重组载体的构建 | 第77-78页 |
| ·Cbfdh-Ccdoc和cyp102a1-Ctdoc中组氨酸标签的除去 | 第78-79页 |
| ·pET-20b-Cbfdh-Ccdoc-nohis和pTrc99a-cyp102a1-Ctdoc-nohis质粒构建 | 第79页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第79页 |
| ·蛋白质相互作用 | 第79-80页 |
| ·生物信息学分析 | 第80页 |
| ·结果和讨论 | 第80-87页 |
| ·mixa3DNA序列的全基因合成和表达 | 第80-81页 |
| ·迷你脚手架蛋白mixA3-His与dockerin体外相互作用 | 第81-82页 |
| ·生物信息学分析 | 第82-87页 |
| 本章小结 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-90页 |
| 第五章 绿色荧光蛋白在毕赤酵母中的表达 | 第90-104页 |
| ·引言 | 第90-91页 |
| ·实验材料及仪器 | 第91-93页 |
| ·菌株与质粒 | 第91页 |
| ·主要仪器 | 第91页 |
| ·主要试剂 | 第91-92页 |
| ·培养基与储存液 | 第92-93页 |
| ·实验方法 | 第93-98页 |
| ·克隆引物设计 | 第93-94页 |
| ·eGFP的体外扩增 | 第94页 |
| ·重组质粒的构建 | 第94-96页 |
| ·阳性转化子的筛选和鉴定 | 第96页 |
| ·毕赤酵母重组表达载体的转化 | 第96-97页 |
| ·重组毕赤酵母细胞的诱导表达 | 第97-98页 |
| ·结果和讨论 | 第98-102页 |
| ·eGFP毕赤酵母表达重组载体的构建 | 第98-99页 |
| ·毕赤酵母转化子PCR鉴定 | 第99-100页 |
| ·重组eGFP诱导分泌表达 | 第100页 |
| ·重组eGFP诱导胞内表达 | 第100-101页 |
| ·eGFP起始密码子局部环境分析 | 第101-102页 |
| 本章小节 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-104页 |
| 第六章 基于脚手架蛋白的毕赤酵母细胞表面展示 | 第104-126页 |
| ·引言 | 第104-105页 |
| ·实验材料及仪器 | 第105-106页 |
| ·菌株与质粒 | 第105页 |
| ·主要试剂 | 第105-106页 |
| ·实验方法 | 第106-110页 |
| ·eGFP定点突变 | 第106页 |
| ·脚手架蛋白表面展示载体的构建 | 第106-108页 |
| ·电激转化至毕赤酵母 | 第108页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达 | 第108页 |
| ·荧光显微镜镜检 | 第108页 |
| ·协同催化以及产物的鉴定 | 第108-109页 |
| ·生物信息学分析 | 第109-110页 |
| ·结果和讨论 | 第110-122页 |
| ·毕赤酵母细胞Kex2的分析 | 第110-117页 |
| ·eGFP的定点突变 | 第117-118页 |
| ·酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p分析 | 第118-119页 |
| ·迷你脚手架蛋白的表面展示 | 第119-121页 |
| ·反应产物的检测 | 第121-122页 |
| 本章小结 | 第122-123页 |
| 参考文献 | 第123-126页 |
| 结论 | 第126-128页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第128-129页 |
