| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第1章 绪论 | 第10-21页 |
| ·手性化合物介绍 | 第10页 |
| ·手性醇简介 | 第10-11页 |
| ·抗胆碱能药物 | 第11页 |
| ·(R)-3-奎宁醇 | 第11-15页 |
| ·化学合成法 | 第12-13页 |
| ·化学拆分法 | 第12页 |
| ·化学不对称催化 | 第12-13页 |
| ·生物催化法 | 第13-15页 |
| ·动力学拆分 | 第13-14页 |
| ·不对称还原法 | 第14-15页 |
| ·羰基还原酶催化合成(R)-3-奎宁醇 | 第15-19页 |
| ·羰基还原酶催化不对称还原反应机制 | 第15-16页 |
| ·辅酶循环策略 | 第16-18页 |
| ·双酶偶联法 | 第17页 |
| ·底物偶联法 | 第17-18页 |
| ·羰基还原酶的来源及筛选 | 第18-19页 |
| ·利用羰基还原酶催化合成(R)-3-奎宁醇的研究现状 | 第19页 |
| ·本课题的研究目的及意义 | 第19-20页 |
| ·本课题主要研究内容 | 第20-21页 |
| 第2章 奎宁酮还原酶的基因挖掘 | 第21-32页 |
| ·引言 | 第21页 |
| ·实验材料 | 第21-23页 |
| ·常用试剂 | 第21页 |
| ·实验仪器与设备 | 第21-22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·菌种及质粒 | 第22-23页 |
| ·实验方法 | 第23-28页 |
| ·基因组及质粒的提取 | 第23页 |
| ·目的片段的扩增 | 第23-25页 |
| ·目的基因及质粒的酶切及连接 | 第25-26页 |
| ·转化 | 第26页 |
| ·菌落PCR | 第26页 |
| ·重组奎宁酮还原酶的表达 | 第26页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第26-27页 |
| ·酶活力的测定 | 第27页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第27页 |
| ·重组奎宁酮还原酶的选择性分析 | 第27页 |
| ·硼氢化钠还原3-奎宁酮制备外消旋3-奎宁醇 | 第27页 |
| ·3-奎宁酮及3-奎宁醇的分析条件 | 第27-28页 |
| ·实验结果及讨论 | 第28-31页 |
| ·奎宁酮还原酶的克隆与表达 | 第28-31页 |
| ·奎宁酮还原酶的功能筛选 | 第31页 |
| ·本章小结 | 第31-32页 |
| 第3章 奎宁酮还原酶的酶学性质研究 | 第32-41页 |
| ·引言 | 第32页 |
| ·实验材料 | 第32页 |
| ·主要试剂 | 第32页 |
| ·仪器设备 | 第32页 |
| ·实验方法 | 第32-34页 |
| ·奎宁酮还原酶的分离纯化 | 第32-33页 |
| ·纯化所需溶液的配制 | 第32-33页 |
| ·粗酶液的制备 | 第33页 |
| ·蛋白的加载 | 第33页 |
| ·设定纯化程序进行蛋白纯化 | 第33页 |
| ·蛋白含量及酶活力的测定 | 第33页 |
| ·蛋白分子量的测定 | 第33页 |
| ·pH对奎宁酮还原酶活力的影响 | 第33-34页 |
| ·温度对奎宁酮还原酶活力的影响 | 第34页 |
| ·奎宁酮还原酶的热稳定性研究 | 第34页 |
| ·EDTA及金属离子对奎宁酮还原酶活力的影响 | 第34页 |
| ·奎宁酮还原酶动力学参数的测定 | 第34页 |
| ·结果与讨论 | 第34-40页 |
| ·奎宁酮还原酶ArQR及SaQR的分离纯化 | 第34-35页 |
| ·蛋白分子量的测定 | 第35页 |
| ·pH对酶活的影响 | 第35-36页 |
| ·温度对酶活的影响 | 第36-37页 |
| ·奎宁酮还原酶的热稳定性研究 | 第37-38页 |
| ·EDTA和金属离子对奎宁酮还原酶的影响 | 第38-39页 |
| ·动力学参数的测定 | 第39-40页 |
| ·本章小结 | 第40-41页 |
| 第4章 ArQR与BmGDH的共表达及催化合成(R)-3-奎宁醇反应研究 | 第41-53页 |
| ·引言 | 第41页 |
| ·实验材料 | 第41页 |
| ·实验方法 | 第41-45页 |
| ·双基因串联重组质粒的构建 | 第41-43页 |
| ·构建共表达质粒所用引物 | 第41页 |
| ·两种双酶共表达载体的构建 | 第41-43页 |
| ·双酶共表达的前后顺序选择 | 第43页 |
| ·双酶共表达重组菌表达条件优化 | 第43页 |
| ·双酶共表达重组菌的发酵及冻干细胞的制备 | 第43-44页 |
| ·双酶共表达重组菌催化3-奎宁酮不对称还原反应 | 第44页 |
| ·双酶共表达重组菌催化3-奎宁酮反应优化 | 第44-45页 |
| ·底物加载量的优化 | 第44页 |
| ·辅酶浓度的优化 | 第44-45页 |
| ·催化剂E. coli BL21(DE3)(pET28-ArQR-BmGDH)冻干细胞上载量的优化 | 第45页 |
| ·结果与讨论 | 第45-51页 |
| ·共表达载体的构建 | 第45-48页 |
| ·共表达的两个基因ArQR及BmGDH在质粒上的先后顺序考察 | 第45-47页 |
| ·E. coli BL21(DE3)(pET28-ArQR-BmGDH)重组菌的表达条件优化 | 第47-48页 |
| ·双酶共表达重组菌的发酵及冻干细胞的制备 | 第48-49页 |
| ·不对称催化3-奎宁酮还原的反应优化 | 第49-51页 |
| ·本章小结 | 第51-53页 |
| 结论和展望 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 附录 | 第61-64页 |
| 硕士在读期间撰写的论文和专利 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
