| 摘要 | 第1-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第16-43页 |
| ·嗜热菌概述 | 第16-17页 |
| ·嗜热菌应用 | 第17-19页 |
| ·嗜热菌耐热性的研究进展 | 第19-23页 |
| ·膜的耐热性研究 | 第19-20页 |
| ·核酸的耐热性研究 | 第20-21页 |
| ·蛋白质的耐热性研究 | 第21-23页 |
| ·蛋白质的稳定性 | 第21页 |
| ·蛋白质的失活机制 | 第21-23页 |
| ·蛋白质耐热性研究进展 | 第23-33页 |
| ·蛋白质耐热性的研究手段 | 第23-25页 |
| ·分子生物学手段 | 第23-24页 |
| ·结构生物学手段 | 第24-25页 |
| ·生物信息学手段 | 第25页 |
| ·蛋白质耐热性的研究范围 | 第25-28页 |
| ·一种酶的同源蛋白质比较 | 第26页 |
| ·多种酶的同源蛋白质比较 | 第26-27页 |
| ·基因组角度分析 | 第27-28页 |
| ·蛋白质热稳定的分子机制和结构分析 | 第28-33页 |
| ·氨基酸组成 | 第28-29页 |
| ·氢键 | 第29页 |
| ·盐桥 | 第29-30页 |
| ·疏水作用 | 第30-31页 |
| ·包装效应和溶剂接触表面积 | 第31页 |
| ·α-螺旋 | 第31-32页 |
| ·Loop区的稳定性 | 第32页 |
| ·温度因子 | 第32-33页 |
| ·脂肪酶的研究进展 | 第33-41页 |
| ·脂肪酶的结构 | 第33-34页 |
| ·脂肪酶的应用领域 | 第34-38页 |
| ·水解反应 | 第34-36页 |
| ·合成反应 | 第36-38页 |
| ·脂肪酶活力的测定方法 | 第38页 |
| ·脂肪酶的工程改造 | 第38-40页 |
| ·未来脂肪酶的发展方向 | 第40-41页 |
| ·本论文研究的内容和意义 | 第41-43页 |
| 2 材料与方法 | 第43-78页 |
| ·材料 | 第43-57页 |
| ·样品 | 第43页 |
| ·菌株和质粒 | 第43页 |
| ·主要试剂 | 第43-44页 |
| ·主要仪器 | 第44-45页 |
| ·引物 | 第45-48页 |
| ·主要分析软件 | 第48页 |
| ·培养基及主要溶液 | 第48-57页 |
| ·基本方法 | 第57-78页 |
| ·细菌染色体总DNA的提取 | 第57页 |
| ·PCR反应 | 第57-58页 |
| ·菌落PCR | 第58页 |
| ·DNA片段回收 | 第58-59页 |
| ·连接反应 | 第59页 |
| ·化学感受态细胞的制备 | 第59-60页 |
| ·化学转化方法 | 第60页 |
| ·常规化学转化方法 | 第60页 |
| ·双杂交系统转化方法 | 第60页 |
| ·质粒少量制备 | 第60-61页 |
| ·SDS-PAGE蛋白凝胶电泳、染色、脱色 | 第61-62页 |
| ·核酸内切酶酶切反应 | 第62页 |
| ·重组质粒表达的小量检测 | 第62页 |
| ·重组蛋白可溶性的确定 | 第62页 |
| ·Glutathione Sepharose 4B纯化重组蛋白 | 第62-63页 |
| ·酶联免疫分析(ELISA) | 第63-64页 |
| ·DNA探针的DIG标记 | 第64-65页 |
| ·细菌总RNA的提取 | 第65页 |
| ·细菌总RNA的纯化 | 第65-66页 |
| ·革兰氏染色 | 第66页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE | 第66页 |
| ·嗜热菌的筛选及热稳定脂肪酶基因的克隆与分析 | 第66-71页 |
| ·嗜热菌的分离与鉴定 | 第66-68页 |
| ·嗜热菌的培养与分离 | 第66-67页 |
| ·16S rDNA的PCR扩增 | 第67页 |
| ·16S rDNA序列的测定与分析 | 第67页 |
| ·菌株生长温度的确定 | 第67-68页 |
| ·菌株形态观察 | 第68页 |
| ·热稳定脂肪酶基因的克隆与分析 | 第68-71页 |
| ·产脂肪酶菌株TW1的筛选与鉴定 | 第68页 |
| ·粗酶提取 | 第68-69页 |
| ·热稳定脂肪酶基因的克隆 | 第69页 |
| ·热稳定脂肪酶基因的重组表达与纯化 | 第69-70页 |
| ·热稳定脂肪酶酶活测定 | 第70页 |
| ·重组脂肪酶作用的最适温度及温度耐受检测 | 第70页 |
| ·重组脂肪酶作用的最适pH确定及pH耐受检测 | 第70-71页 |
| ·抑制剂或去污剂对重组脂肪酶酶活的影响 | 第71页 |
| ·金属离子对重组脂肪酶酶活的影响 | 第71页 |
| ·抗血清的纯化 | 第71-72页 |
| ·抗体的纯化步骤 | 第71-72页 |
| ·抗体最适滴度的确定 | 第72页 |
| ·蛋白的Western blot印迹杂交 | 第72-73页 |
| ·Northern blot印迹杂交 | 第73-74页 |
| ·电泳分离 | 第73页 |
| ·RNA电转移 | 第73页 |
| ·杂交 | 第73-74页 |
| ·杂交信号检测 | 第74页 |
| ·蛋白双向电泳(two-dimensional electrophorese) | 第74-76页 |
| ·样品制备 | 第74-75页 |
| ·IPG胶条的水化和电泳 | 第75-76页 |
| ·样品水化及聚焦 | 第75页 |
| ·IPG胶条的平衡及电泳 | 第75-76页 |
| ·免疫共沉淀 | 第76页 |
| ·嗜热菌电转化方法 | 第76-78页 |
| 3 结果与分析 | 第78-124页 |
| ·嗜热菌的筛选及热稳定脂肪酶的性质研究 | 第78-89页 |
| ·嗜热菌的分离与鉴定 | 第78-81页 |
| ·嗜热菌的分离 | 第78-80页 |
| ·嗜热菌的鉴定 | 第80-81页 |
| ·热稳定脂肪酶的性质研究 | 第81-89页 |
| ·产脂肪菌株的筛选与鉴定 | 第81-82页 |
| ·热稳定脂肪酶基因的克隆及序列分析 | 第82-85页 |
| ·重组脂肪酶的表达与纯化 | 第85-86页 |
| ·重组脂肪酶的性质分析 | 第86-89页 |
| ·重组脂肪酶特定底物的确定 | 第86页 |
| ·温度对重组脂肪酶酶活的影响 | 第86页 |
| ·pH值对脂肪酶酶活的影响 | 第86-87页 |
| ·抑制剂及去垢剂对脂肪酶酶活的的影响 | 第87-88页 |
| ·金属离子对脂肪酶酶活的的影响 | 第88-89页 |
| ·嗜热菌的热适应机理初步研究 | 第89-124页 |
| ·Thermus thermophilus WL热适应相关蛋白的蛋白质组学分析 | 第89-96页 |
| ·T.thermophilus WL全菌蛋白的SDS-PAGE分析 | 第89-90页 |
| ·Trcine-SDS-PAGE凝胶电泳分析 | 第90页 |
| ·2-D凝胶电泳分析 | 第90-91页 |
| ·MALDI-TOF MS质谱鉴定 | 第91-96页 |
| ·高温差异表达蛋白编码基因的转录与表达分析 | 第96-107页 |
| ·差异表达蛋白编码基因的Northern blot分析 | 第96-100页 |
| ·差异蛋白编码基因的扩增及其标记 | 第96-97页 |
| ·不同培养温度下菌体总RNA提取 | 第97-98页 |
| ·16S rRNA探针制备与效率检测 | 第98页 |
| ·Northern blot分析 | 第98-100页 |
| ·差异表达蛋白的Western blot分析 | 第100-107页 |
| ·FUH、SOD和TE-RE基因的表达与重组蛋白的纯化 | 第100-105页 |
| ·抗体制备 | 第105-106页 |
| ·Western blot分析 | 第106-107页 |
| ·SOD基因的热适应性功能研究 | 第107-113页 |
| ·嗜热菌SOD突变株的构建 | 第107-109页 |
| ·SOD突变株(SOD~-)的筛选 | 第109页 |
| ·SOD~-株的分子验证 | 第109-111页 |
| ·SOD突变株的的生长温度测定 | 第111-112页 |
| ·添加重组SOD对突变株生长温度的影响 | 第112-113页 |
| ·蛋白相互作用分析 | 第113-124页 |
| ·SOD互作蛋白的获得 | 第113-115页 |
| ·SOD结合蛋白的Western blot分析 | 第115-117页 |
| ·细菌双杂交系统验证SOD与2-酮异戊酸脱氢酶α亚基的互作 | 第117-123页 |
| ·重组质粒的构建 | 第117-119页 |
| ·SOD和2-酮异戊酸脱氢酶α亚基的互作 | 第119-123页 |
| ·热适应性有关的蛋白分类 | 第123-124页 |
| 4 讨论 | 第124-127页 |
| ·嗜热菌的筛选与鉴定 | 第124页 |
| ·热稳定脂肪酶的研究 | 第124-125页 |
| ·嗜热菌的热适应机理研究 | 第125-127页 |
| 5 结论与展望 | 第127-130页 |
| ·结论 | 第127-128页 |
| ·展望 | 第128-130页 |
| 参考文献 | 第130-141页 |
| 附录 | 第141-146页 |
| 附录1 攻读博士学位期间发表的论文及申请的专利 | 第141页 |
| 附录2 攻读博士学位期间参与的科研项目 | 第141-142页 |
| 附录3 质粒图谱 | 第142-146页 |
| 致谢 | 第146页 |
