| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-11页 |
| 1 引言 | 第11-22页 |
| ·S—腺苷蛋氨酸研究概况 | 第11-17页 |
| ·SAM在生物体内的生理作用 | 第11-12页 |
| ·转甲基作用 | 第11-12页 |
| ·转氨丙基作用 | 第12页 |
| ·转硫作用 | 第12页 |
| ·SAM稳定化研究 | 第12-13页 |
| ·临床应用研究 | 第13-14页 |
| ·肝病 | 第13页 |
| ·抑郁症 | 第13-14页 |
| ·关节炎 | 第14页 |
| ·纤维性肌痛、偏头痛 | 第14页 |
| ·其它 | 第14页 |
| ·SAM的生产现状 | 第14-15页 |
| ·体外酶促法合成 | 第14-15页 |
| ·化学法合成 | 第15页 |
| ·微生物法合成 | 第15页 |
| ·国内外研究进展 | 第15页 |
| ·S-腺苷甲硫氨酸合成酶及其基因 | 第15-17页 |
| ·大肠杆菌的腺苷蛋氨酸合成酶及其基因 | 第15-16页 |
| ·酵母的腺苷蛋氨酸合成酶及其编码基因 | 第16页 |
| ·大鼠腺苷蛋氨酸合成酶及其编码基因 | 第16-17页 |
| ·其它 | 第17页 |
| ·腺苷蛋氨酸合成酶基因工程酶的构建和转化研究 | 第17页 |
| ·腺苷蛋氨酸合成酶基因工程菌的构建 | 第17页 |
| ·外源蛋白的基因工程表达系统 | 第17-20页 |
| ·表达系统的选择 | 第17-19页 |
| ·大肠杆菌表达载体pET20b(+)和宿主菌BL21(DE3)简介 | 第19-20页 |
| ·表达方式的选择 | 第20-21页 |
| ·本论文的立题依据及研究内容 | 第21-22页 |
| ·立题依据 | 第21页 |
| ·主要研究内容 | 第21-22页 |
| 2 材料和试剂 | 第22-26页 |
| ·主要仪器设备 | 第22页 |
| ·菌株和质粒 | 第22-23页 |
| ·主要试剂 | 第23页 |
| ·培养基和常用溶液配制 | 第23-26页 |
| 3 酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第26-55页 |
| ·构建策略 | 第26-28页 |
| ·TA克隆 | 第26-27页 |
| ·胞外表达载体构建策略 | 第27-28页 |
| ·胞内表达载体构建策略 | 第28页 |
| ·实验方法 | 第28-39页 |
| ·酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因的PCR扩增 | 第28-30页 |
| ·引物的设计 | 第28-29页 |
| ·Saccharomyces cerevisiae NL365染色体的提取 | 第29页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第29页 |
| ·PCR产物的回收 | 第29-30页 |
| ·PCR产物的TA克隆 | 第30-32页 |
| ·连接 | 第30页 |
| ·大肠杆菌TG1感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| ·连接产物转化TG1感受态细胞 | 第31页 |
| ·质粒的提取 | 第31页 |
| ·酶切鉴定 | 第31-32页 |
| ·胞外表达载体的构建 | 第32-34页 |
| ·双酶切获得目的片段 | 第32-33页 |
| ·双酶切获得载体 | 第33页 |
| ·构建胞外表达重组质粒 | 第33页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·胞内表达重组载体的构建 | 第34-35页 |
| ·全质粒PCR扩增 | 第34页 |
| ·Nde Ⅰ部分酶切全质粒PCR扩增产物 | 第34-35页 |
| ·胞内表达重组质粒的构建 | 第35页 |
| ·胞内表达重组质粒的酶切鉴定 | 第35页 |
| ·表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第35-37页 |
| ·胞内表达产物的酶活测定 | 第37-38页 |
| ·酶活定义 | 第37页 |
| ·反应原理 | 第37页 |
| ·腺苷蛋氨酸的分析检测方法 | 第37页 |
| ·标准曲线的制作 | 第37-38页 |
| ·细胞壁的破碎 | 第38页 |
| ·酶活测定方法 | 第38页 |
| ·胞内SAM含量的测定 | 第38页 |
| ·表达产物是否为包涵体的鉴定 | 第38-39页 |
| ·结果与讨论 | 第39-54页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第39页 |
| ·TA克隆的酶切鉴定结果 | 第39-40页 |
| ·测序结果分析 | 第40-43页 |
| ·胞外表达重组质粒的构建及鉴定 | 第43-44页 |
| ·双酶切pT-sam2获得目的片段 | 第43页 |
| ·载体pET20b(+)的双酶切及pETO-sam2的构建 | 第43-44页 |
| ·重组载体pETO-sam2的双酶切鉴定 | 第44页 |
| ·胞内表达重组质粒的构建及鉴定 | 第44-46页 |
| ·全质粒PCR扩增产物的电泳检测 | 第44页 |
| ·全质粒PCR扩增产物的NdeⅠ部分酶切 | 第44-45页 |
| ·重组载体pETI-sam2的双酶切鉴定 | 第45-46页 |
| ·诱导表达产物的SDS-PAGE鉴定及酶活测定 | 第46-49页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第46页 |
| ·SAM标准曲线的制作 | 第46-47页 |
| ·表达产物的酶活测定 | 第47页 |
| ·胞内SAM含量的测定 | 第47页 |
| ·表达产物是否为包涵体的鉴定 | 第47-48页 |
| ·诱导物浓度对产物表达的影响 | 第48-49页 |
| ·诱导时间对产物表达的影响 | 第49页 |
| ·讨论 | 第49-54页 |
| ·关于部分酶切 | 第49-50页 |
| ·关于全质粒PCR | 第50页 |
| ·pETO-sam2对BL21(DE3)致死的可能原因 | 第50-51页 |
| ·关于测序结果的讨论 | 第51-53页 |
| ·诱导温度对产物表达的影响 | 第53页 |
| ·乳糖代替IPTG作诱导物的可行性实验 | 第53-54页 |
| ·展望 | 第54-55页 |
| 结论 | 第55-56页 |
| 附录A | 第56-57页 |
| A.1 酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因DNA序列 | 第56页 |
| A.2 酵母腺苷蛋氨酸合成酶基因的蛋白质序列 | 第56-57页 |
| 附录B | 第57-61页 |
| B.1 SAM2测序结果(N端) | 第57-59页 |
| B.2 SAM2测序结果(C端) | 第59-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-66页 |
