| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-37页 |
| 第一节 可应用于病毒受体研究的几种生物技术途径 | 第12-24页 |
| 1 噬菌体表面展示技术(Phage surface display techniques，PSDT) | 第13-14页 |
| 2 病毒铺覆蛋白印迹技术(Virus overlay protein blot assay，VOPBA) | 第14-15页 |
| 3 层析法(Chromatography) | 第15-16页 |
| 4 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system) | 第16-17页 |
| 5 单克隆抗体技术(Monoclonal antibody technique) | 第17-18页 |
| 6 受体基因的克隆及表达 | 第18-24页 |
| 第二节 酵母双杂交系统的研究进展 | 第24-37页 |
| 1 酵母双杂交系统的基本原理 | 第25-26页 |
| 2 酵母双杂交技术的应用研究现状及其局限性 | 第26-28页 |
| 3 酵母双杂交系统的改进与发展 | 第28-37页 |
| 第二章 VAP1基因的改造与pGBKT7-VAP1诱饵重组质粒的构建 | 第37-71页 |
| 第一节 VAP1基因的改造 | 第37-39页 |
| 1.材料与方法 | 第37-39页 |
| ·VAP1的功能与基因改造的原因 | 第37-38页 |
| ·改造后的VAP1及分析 | 第38-39页 |
| 第二节 VAP1基因的克隆 | 第39-50页 |
| 1.材料与方法 | 第39-43页 |
| ·引物设计 | 第39页 |
| ·WSSV DNA模板的提取 | 第39-41页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第41-42页 |
| ·PCR产物的检测与定量 | 第42页 |
| ·PCR产物的纯化与定量 | 第42-43页 |
| 2.结果与分析 | 第43-48页 |
| ·WSSV病毒的提纯 | 第43-44页 |
| ·引物设计结果 | 第44-47页 |
| ·扩增结果 | 第47-48页 |
| 3.讨论 | 第48-50页 |
| 第三节 pGBKT7-VAP1诱饵重组质粒的构建与扩增 | 第50-57页 |
| 1.材料与方法 | 第50-54页 |
| ·材料、试剂与培养基 | 第50页 |
| ·VAP1 PCR产物的酶切 | 第50-51页 |
| ·酶切产物的纯化定量 | 第51页 |
| ·pGBKT7载体质粒的构造、双酶切、纯化与定量 | 第51页 |
| ·VAP1与线性载体pGBKT7的连接 | 第51-52页 |
| ·重组载体pGBKT7 DNA-BD／VAP1的转化、双酶切及PCR鉴定 | 第52-54页 |
| 2.结果与分析 | 第54-56页 |
| ·pGBKT7-VAP1重组质粒的转化效率、提取及双酶切鉴定 | 第54-55页 |
| ·pGBKT7-VAP1的PCR鉴定 | 第55页 |
| ·插入片段的测序与分析 | 第55-56页 |
| 3.讨论 | 第56-57页 |
| 第四节 pGBKT7-VAP1的酵母转化与自激活作用检测 | 第57-71页 |
| 1.材料与方法 | 第57-65页 |
| ·酵母双杂交的实验流程 | 第57页 |
| ·GAL4系统所用酵母菌株与载体 | 第57-62页 |
| ·重组质粒pGBKT7-VAP1转化酵母菌AH109和Y187 | 第62-64页 |
| ·自激活作用检测 | 第64-65页 |
| ·诱饵融合蛋白毒性检测 | 第65页 |
| 2.结果 | 第65-69页 |
| ·酵母重组质粒的提取 | 第65页 |
| ·重组质粒转化酵母细胞的PCR鉴定 | 第65-66页 |
| ·转化效率 | 第66页 |
| ·诱饵融合蛋白自激活作用检测 | 第66-68页 |
| ·融合蛋白毒性检测 | 第68-69页 |
| 3.讨论 | 第69-71页 |
| 第三章 AH109[cDNA Library]与Y187[pGBKT7-VAP1]的酵母融合与阳性克隆的确定 | 第71-85页 |
| 第一节 AH109[cDNA]与Y187[pGBKT7-VAP1]的融合与选择性培养 | 第71-78页 |
| 1.材料与方法 | 第71-74页 |
| ·缺陷性培养基的配制 | 第71页 |
| ·试剂、材料与仪器 | 第71页 |
| ·AH109[cDNA Library]与Y187[pGBKT7-VAP1]的酵母融合 | 第71-72页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第72-74页 |
| ·酵母融合对照组情况 | 第74页 |
| 2.结果 | 第74-76页 |
| ·融合过程观察 | 第74-75页 |
| ·融合效率 | 第75页 |
| ·PCR扩增cDNA片段 | 第75-76页 |
| ·融合酵母对照组情况 | 第76页 |
| 3.讨论 | 第76-78页 |
| 第二节 阳性克隆的序列测定与分析 | 第78-85页 |
| 1.材料与方法 | 第78页 |
| ·cDNA插入片段的序列测定 | 第78页 |
| ·cDNA插入片段的生物信息学分析 | 第78页 |
| 2.结果 | 第78-83页 |
| ·cDNA插入片段的测序结果 | 第78页 |
| ·cDNA插入片段的序列分析 | 第78-83页 |
| 3.讨论 | 第83-85页 |
| 第四章 对虾鳃膜蛋白的研究 | 第85-102页 |
| 第一节 凡纳滨对虾鳃细胞膜的提取与膜蛋白的增溶 | 第85-89页 |
| 1.材料与方法 | 第85-87页 |
| ·凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃细胞膜的提取 | 第85页 |
| ·鳃细胞膜的DIG标记 | 第85-86页 |
| ·DIG标记鳃细胞膜的增溶 | 第86页 |
| ·ELISA检测结合活性 | 第86-87页 |
| 2.结果 | 第87-88页 |
| ·凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃细胞膜的提取 | 第87-88页 |
| ·两种增溶剂对膜蛋白与WSSV结合活性的影响 | 第88页 |
| 3 讨论 | 第88-89页 |
| 第二节 P53鳃膜蛋白的测序 | 第89-102页 |
| ·鳃膜蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第89页 |
| ·P53鳃膜蛋白的MODLI-TOF-MS-MS测序 | 第89-90页 |
| ·鳃膜蛋白的阿尔新蓝(Alcian Blue)染色法(检测糖蛋白) | 第90页 |
| 2.结果 | 第90-100页 |
| ·鳃膜蛋白的SDS-PAGE | 第90页 |
| ·P53鳃膜蛋白测序结果 | 第90-100页 |
| ·鳃膜蛋白中糖蛋白的确定 | 第100页 |
| 3.讨论 | 第100-102页 |
| 附录 | 第102-107页 |
| (一).Cutted-VAP1基因克隆序列测序图 | 第102-103页 |
| (二) 筛选的基因序列测序图 | 第103-104页 |
| (三).主要培养基及试剂配方 | 第104-107页 |
| 致谢 | 第107页 |
