| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略词表 | 第8-10页 |
| 目录 | 第10-14页 |
| 引言 | 第14-16页 |
| 1 产肠毒素大肠杆菌的肠毒素及其疫苗、卵黄免疫球蛋白的研究概况 | 第16-37页 |
| ·肠毒素及其疫苗 | 第16-30页 |
| ·肠毒素的生物学特征及致病机理 | 第16-26页 |
| ·基因工程疫苗 | 第26-27页 |
| ·DNA疫苗 | 第27-28页 |
| ·ETEC肠毒素基因工程疫苗的研究进展 | 第28-30页 |
| ·卵黄免疫球蛋白 | 第30-35页 |
| ·卵黄免疫球蛋白概述 | 第30-32页 |
| ·IgY相对于哺乳动物IgG的优势 | 第32-33页 |
| ·IgY在动物疾病防治领域的应用 | 第33-35页 |
| ·论文选题依据及研究内容 | 第35-37页 |
| ·选题依据 | 第35-36页 |
| ·研究内容 | 第36-37页 |
| 2 三价肠毒素DNA疫苗的载体构建与大量制备 | 第37-72页 |
| ·引言 | 第37页 |
| ·实验材料 | 第37-38页 |
| ·实验方法 | 第38-50页 |
| ·冻干菌种的恢复培养与鉴定 | 第38-39页 |
| ·三价肠毒素基因融合顺序及重叠延伸PCR引物的设计 | 第39-41页 |
| ·信号肽基因ins、upa及肠毒素基因STa的PCR扩增 | 第41页 |
| ·肠毒素基因LTB和STb的PCR扩增 | 第41页 |
| ·二价融合基因的PCR扩增 | 第41-42页 |
| ·三价融合基因的PCR扩增 | 第42-43页 |
| ·三价肠毒素基因克隆至U载体pDrive中 | 第43-45页 |
| ·克隆三价肠毒素基因至pCI载体 | 第45-47页 |
| ·柱层析法纯化三价肠毒素DNA疫苗 | 第47-48页 |
| ·三价肠毒素DNA疫苗在真核细胞内的表达 | 第48-50页 |
| ·结果与分析 | 第50-69页 |
| ·ETEC F4ac冻干菌种的恢复培养与鉴定 | 第50-51页 |
| ·PCR扩增获得信号肽基因ins、upa及肠毒素基因STa | 第51-53页 |
| ·PCR扩增获得肠毒素基因LTB和STb | 第53页 |
| ·PCR扩增获得二价融合基因 | 第53-54页 |
| ·PCR扩增获得三价融合基因 | 第54-56页 |
| ·三价肠毒素基因克隆载体的构建 | 第56-60页 |
| ·DNA序列分析 | 第60-61页 |
| ·DNA疫苗pCI-ins-SLS、pCI-upa-SLS、pCI-SLS的构建 | 第61-66页 |
| ·DNA疫苗pCI-ins-SLS、pCI-upa-SLS、pCI-SLS的制备 | 第66-68页 |
| ·DNA疫苗在真核细胞内的表达 | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 3 重组肠毒素原核表达质粒的构建及蛋白表达与纯化 | 第72-118页 |
| ·引言 | 第72页 |
| ·实验材料 | 第72-73页 |
| ·实验方法 | 第73-92页 |
| ·溶液中DNA片段的纯化与回收 | 第73-74页 |
| ·感受态E.coli细胞的制备 | 第74页 |
| ·质粒DNA转化感受态E.coli细胞 | 第74-75页 |
| ·构建单价肠毒素表达载体pET30-LTB | 第75-77页 |
| ·构建单价肠毒素表达载体pET32-STb | 第77-78页 |
| ·构建三价肠毒素表达载体pET30-LSS | 第78-82页 |
| ·构建三价肠毒素表达载体pET30-SLS | 第82-84页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第84-85页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第85-86页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第86-88页 |
| ·蛋白质免疫印迹检测(Western blot) | 第88-90页 |
| ·包涵体蛋白初步纯化 | 第90-91页 |
| ·重组蛋白的亲和纯化 | 第91-92页 |
| ·结果与分析 | 第92-116页 |
| ·表达肠毒素LTB的重组菌株的获得 | 第92-96页 |
| ·表达肠毒素STb的重组菌株的获得 | 第96-101页 |
| ·表达三价肠毒素LSS的重组菌株的获得 | 第101-104页 |
| ·表达三价肠毒素SLS的重组菌株的获得 | 第104-108页 |
| ·重组肠毒素蛋白的诱导表达 | 第108-110页 |
| ·重组肠毒素蛋白的Western blot鉴定 | 第110-111页 |
| ·重组肠毒素蛋白诱导表达条件的优化 | 第111-115页 |
| ·重组肠毒素蛋白的亲和纯化 | 第115-116页 |
| ·讨论 | 第116-117页 |
| ·小结 | 第117-118页 |
| 4 ETEC多价肠毒素DNA疫苗及蛋白疫苗免疫原性的评价 | 第118-138页 |
| ·引言 | 第118页 |
| ·实验材料 | 第118-119页 |
| ·实验方法 | 第119-124页 |
| ·大肠杆菌F4的培养及甲醛灭活 | 第119页 |
| ·蛋鸡免疫 | 第119-120页 |
| ·水稀释法分离IgY | 第120页 |
| ·小鼠的免疫与攻毒 | 第120-122页 |
| ·乳鼠实验测定STa的活性 | 第122页 |
| ·乳鼠实验测定STb的活性 | 第122页 |
| ·抗体中和活性的测定 | 第122-123页 |
| ·酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测抗体效价 | 第123-124页 |
| ·统计分析方法 | 第124页 |
| ·结果与分析 | 第124-136页 |
| ·DNA疫苗诱导蛋鸡产生的IgY的效价 | 第124-126页 |
| ·蛋白疫苗诱导蛋鸡产生的IgY的效价 | 第126-127页 |
| ·特异性IgY中和ST毒性的测定 | 第127-129页 |
| ·蛋白及DNA疫苗诱导小鼠产生的IgG的效价 | 第129-132页 |
| ·小鼠抗血清中和ST毒性的测定 | 第132-134页 |
| ·重组肠毒素蛋白毒性的测定 | 第134-135页 |
| ·小鼠攻毒保护实验结果 | 第135-136页 |
| ·讨论 | 第136-137页 |
| ·小结 | 第137-138页 |
| 结论与展望 | 第138-140页 |
| 结论 | 第138页 |
| 展望 | 第138-140页 |
| 创新点摘要 | 第140-141页 |
| 参考文献 | 第141-150页 |
| 附录A 主要仪器及设备 | 第150-151页 |
| 附录B 重组质粒测序结果 | 第151-159页 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 | 第159-160页 |
| 致谢 | 第160-161页 |
| 作者简介 | 第161-162页 |
