| 第一部分 HBV编码的反式激活蛋白调控端粒酶活性的作用及机制研究 | 第1-63页 |
| 中文摘要 | 第8-14页 |
| ABSTRACT | 第14-21页 |
| 符号说明 | 第21-23页 |
| 前言 | 第23-26页 |
| 材料 | 第26-31页 |
| 1.质粒与菌株 | 第26页 |
| 2.细胞和细胞培养 | 第26页 |
| 3.引物 | 第26-27页 |
| 4.反义寡核苷酸序列 | 第27-28页 |
| 5.抗体 | 第28页 |
| 6.生化试剂 | 第28页 |
| 7.一般试剂 | 第28-31页 |
| 8.主要实验仪器 | 第31页 |
| 方法 | 第31-52页 |
| 1.质粒DNA的制备 | 第31-32页 |
| ·工程菌的活化与扩增 | 第31-32页 |
| ·质粒DNA的小量抽提纯化 | 第32页 |
| ·质粒DNA的纯化 | 第32页 |
| 2.系列缺失型hTERT启动子质粒的构建 | 第32-38页 |
| ·系列缺失型hTERT启动子基因的扩增 | 第32-33页 |
| ·系列缺失hTERT启动子基因片断的大量酶切回收 | 第33-34页 |
| ·质粒pGL3-basic的酶切线性化与回收 | 第34-35页 |
| ·系列缺失hTERT启动子基因片断与载体的连接 | 第35页 |
| ·连接产物的转化 | 第35-36页 |
| ·阳性重组子的筛选鉴定 | 第36-38页 |
| ·阳性克隆的保存 | 第38页 |
| 3.突变体hTERT启动子报告质粒的构建 | 第38-40页 |
| ·系列突变型hTERT启动子基因的扩增 | 第38页 |
| ·系列突变型hTERT启动子的大量酶切回收 | 第38页 |
| ·质粒pGL3-basic的酶切线性化与回收 | 第38页 |
| ·系列突变型hTERT启动子基因片断与载体的连接与转化 | 第38页 |
| ·阳性重组子的筛选鉴定 | 第38页 |
| ·其他突变体的构建 | 第38-40页 |
| 4.截短型HBx重组子的构建 | 第40-42页 |
| ·截短型HBx的扩增 | 第40-41页 |
| ·截短型HBx的大量酶切回收 | 第41-42页 |
| ·质粒pcDNA3-HBx的酶切线性化与回收 | 第42页 |
| ·连接与转化 | 第42页 |
| ·阳性重组子的筛选鉴定 | 第42页 |
| 5.HepG2细胞培养 | 第42页 |
| 6.脂质体转染 | 第42-44页 |
| ·HBx过表达对端粒酶活性的影响 | 第42-43页 |
| ·HBx对全长hTERT启动子的作用 | 第43-44页 |
| ·HBx对系列缺失及突变体hTERT启动子的作用 | 第44页 |
| ·截短HBx表达载体对全长hTERT启动子的激活作用 | 第44页 |
| 7.端粒酶活性检测 | 第44-46页 |
| ·蛋白的裂解收集 | 第44页 |
| ·端粒酶介导的端粒重复序列延伸(TRAP)检测端粒酶活性 | 第44-45页 |
| ·12%聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第45页 |
| ·快速银染 | 第45-46页 |
| 8.RT-PCR检测hTERT mRNA的表达 | 第46-48页 |
| ·细胞RNA的抽提 | 第46-47页 |
| ·逆转录扩增反应 | 第47-48页 |
| 9.反义封闭实验 | 第48-49页 |
| 10.Western-blot检测蛋白的表达 | 第49-51页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第49-50页 |
| ·Western-blot检测蛋白表达 | 第50-51页 |
| 11.荧光素酶表达量的测定 | 第51-52页 |
| ·细胞的收集与裂解 | 第51页 |
| ·荧光素酶表达量的测定 | 第51-52页 |
| 结果 | 第52-58页 |
| 1.PreS2与HBx对端粒酶活性的影响 | 第52-53页 |
| ·HBx与PreS2在肝癌细胞HepG2中的表达 | 第52页 |
| ·HBx与PreS2过表达明显增强HepG2细胞端粒酶活性 | 第52页 |
| ·HBx与PreS2过表达明显增强HepG2细胞中hTERT mRNA表达 | 第52-53页 |
| ·反义封闭HBx与PreS2基因抑制HepG2.2.15细胞中hTERT mRNA表达 | 第53页 |
| 2.HBx对端粒酶逆转录酶启动子的调控作用 | 第53-56页 |
| ·系列缺失型与突变型hTERT启动子报告载体的构建 | 第53-54页 |
| ·突变型hTERT启动子pGL3B-del132 mt3和pGL3B-del132 mt4的构建 | 第54页 |
| ·突变型hTERT启动子pGL3B-del132 mt5的构建 | 第54页 |
| ·DNA测序及序列分析 | 第54-55页 |
| ·HBx对全长hTERT启动子的反式激活作用 | 第55页 |
| ·HBx通过作用于hTERT启动子-197～+37区域促进启动子转录 | 第55-56页 |
| ·HBx通过Sp1结合位点反式激活hTERT启动子 | 第56页 |
| ·HBx对Sp1表达水平的影响 | 第56页 |
| 3.激活hTERT表达最小HBx关键片段的寻找 | 第56-58页 |
| ·系列截短型HBx真核表达载体的构建 | 第56-57页 |
| ·RT-PCR检测系列截短型HBx在肝癌细胞的表达 | 第57页 |
| ·Western-blot检测系列截短型HBx在肝癌细胞的表达 | 第57页 |
| ·系列截短型HBx对端粒酶启动子的作用 | 第57-58页 |
| 讨论 | 第58-61页 |
| 总结 | 第61-63页 |
| 第二部分 鼠A白蛋白表达调控机制的研究 | 第63-101页 |
| 中文摘要 | 第63-67页 |
| ABSTRACT | 第67-72页 |
| 符号说明 | 第72-73页 |
| 前言 | 第73-75页 |
| 材料 | 第75-76页 |
| 1.菌株与质粒: | 第75页 |
| 2.细胞株 | 第75页 |
| 3.抗体 | 第75页 |
| 4.试剂盒 | 第75页 |
| 5.主要试剂 | 第75-76页 |
| 6.主要仪器 | 第76页 |
| 方法 | 第76-94页 |
| 1.质粒DNA的制备 | 第76-80页 |
| ·感受态细菌的制备 | 第76-77页 |
| ·质粒的转化 | 第77页 |
| ·阳性克隆的筛选鉴定 | 第77页 |
| ·碱变性法小量抽提质粒 | 第77-78页 |
| ·酶切筛选阳性重组子 | 第78页 |
| ·溴化乙锭氯化铯梯度离心法大量提取质粒 | 第78-80页 |
| 2.小鼠AFM基因核心启动子质粒的构建 | 第80-81页 |
| ·目的片断mAFM的获取 | 第80页 |
| ·载体pGL3-basic线性化 | 第80页 |
| ·目的片断mAFM与载体pGL3-basic的回收与纯化 | 第80-81页 |
| ·目的基因AFM与载体的连接、转化 | 第81页 |
| ·阳性克隆株pGL3-mAFM的鉴定 | 第81页 |
| 3.系列截短型mAFM启动子质粒的构建 | 第81-84页 |
| ·系列截短型mAFM启动子的扩增 | 第81-82页 |
| ·缺失mAFM启动子片断的大量回收纯化 | 第82页 |
| ·缺失mAFM启动子与pGEMT-easy载体连接、转化 | 第82页 |
| ·阳性克隆的筛选鉴定 | 第82-83页 |
| ·DNA自动测序与序列分析 | 第83页 |
| ·缺失型mAFM启动子荧光素酶报告载体的构建 | 第83-84页 |
| 4.突变体mAFM启动子质粒的构建 | 第84-87页 |
| ·第一个HNF1结合位点突变的mAFM启动子质粒的构建 | 第84-85页 |
| ·第二个HNF1结合位点突变的mAFM启动子载体的构建 | 第85-86页 |
| ·双突变HNF1结合位点mAFM启动子的构建 | 第86-87页 |
| 5.细胞的培养: | 第87页 |
| 6.RT-PCR检测AFM mRNA表达 | 第87-88页 |
| ·细胞RNA的抽提 | 第87页 |
| ·逆转录扩增反应 | 第87-88页 |
| 7.AFM启动子在不同细胞中的活性 | 第88-89页 |
| 8.HNF1对mAFM启动子的作用 | 第89-90页 |
| ·HNF1α或HNF1β单独对AFM启动子的作用 | 第89页 |
| ·HNF1α与HNF1β联合对AFM启动子的作用 | 第89-90页 |
| 9.C/EBP对mAFM启动子的作用 | 第90页 |
| 10.细胞的收集与裂解 | 第90页 |
| 11.荧光素酶表达量的测定 | 第90-91页 |
| 12.凝胶迁移实验EMSA | 第91-94页 |
| ·HNF1转染HEK293细胞 | 第91页 |
| ·核蛋白的提取 | 第91页 |
| ·蛋白浓度的测定(BCA试剂盒) | 第91-92页 |
| ·探针的标记 | 第92-93页 |
| ·DNA与蛋白质的结合反应 | 第93页 |
| ·8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第93-94页 |
| 结果 | 第94-101页 |
| 1.AFM基因启动子报告载体的构建 | 第94页 |
| 2.系列缺失型mAFM启动子报告载体的构建 | 第94-95页 |
| ·系列缺失型mAFM基因启动子的TA克隆载体构建: | 第94-95页 |
| ·DNA测序及序列分析 | 第95页 |
| ·系列缺失型荧光素酶报告载体的构建 | 第95页 |
| 3.系列突变型mAFM启动子报告载体的构建 | 第95-97页 |
| ·重组子pGL3-HNF1mt1的构建 | 第95-96页 |
| ·重组子pGL3-HNF1mt2的构建 | 第96-97页 |
| ·重组子pGL3-HNF1mt12的构建 | 第97页 |
| 4.不同细胞系中AFM的表达 | 第97页 |
| 5.AFM启动子在不同细胞系中的活性 | 第97-98页 |
| 6.HNF1转录因子对AFM启动子的激活作用 | 第98页 |
| 7.AFM基因启动子区HNF1反应元件与蛋白相互作用分析 | 第98-99页 |
| 8.site1与site2序列结合能力分析 | 第99页 |
| 9.缺失与突变mAFM启动子转录活性的研究 | 第99-100页 |
| 10.HNF1α及HNF1β转录因子对突变型AFM启动子的激活作用 | 第100页 |
| 11.HNF1β对HNF1α激活作用的调控作用 | 第100-101页 |
| 12.C/EBP转录因子对mAFM启动子的激活作用 | 第101页 |
| 讨论 | 第101-105页 |
| 小结 | 第105-106页 |
| 附录 | 第106-108页 |
| 第一部分 附图 | 第108-122页 |
| 第二部分 附图 | 第122-135页 |
| 综述一 端粒酶逆转录酶调控机制的研究概述 | 第135-141页 |
| 综述二 HBX研究现状 | 第141-146页 |
| 综述三 白蛋白家族研究进展 | 第146-151页 |
| 参考文献 | 第151-169页 |
| 发表文章 | 第169-175页 |
| 待发表文章 | 第175-190页 |
| 致谢 | 第190-191页 |
| 博士期间发表的论文 | 第191页 |
| 会议交流论文 | 第191-192页 |
| 荣誉与奖励 | 第192-193页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第193页 |
