缩略词表 | 第1-7页 |
中文摘要 | 第7-10页 |
Abstract | 第10-14页 |
前言 | 第14-19页 |
第一部分.带His标签的HPPCn蛋白的表达纯化以及SMMC7721 细胞膜蛋白的分离 | 第19-36页 |
一、实验材料 | 第19-23页 |
1. 菌株及质粒载体 | 第19-20页 |
2. 细胞培养 | 第20页 |
3. 主要试剂 | 第20页 |
4. 主要仪器 | 第20-21页 |
5. 所需试剂的配制 | 第21-23页 |
二、实验方法 | 第23-28页 |
1. 表达带His标签的HPPCn工程菌的鉴定 | 第23-25页 |
2. 最佳诱导条件的确定 | 第25页 |
3. 摇瓶大量培养工程菌收集菌体及蛋白表达鉴定 | 第25-26页 |
4. 菌体超声破碎收集上清 | 第26页 |
5. 色谱纯化 | 第26-27页 |
6. SMMC7721 细胞膜蛋白的提取 | 第27-28页 |
三、实验结果 | 第28-33页 |
1. 工程菌BL21(DE3)-pET-24a (+)-His-HPPCn鉴定结果 | 第28-29页 |
2. 最佳诱导条件选择 | 第29页 |
3. 摇瓶培养蛋白表达鉴定 | 第29-30页 |
4. 超声破碎获取目的蛋白 | 第30页 |
5. 色谱纯化 | 第30-33页 |
四、讨论 | 第33-36页 |
第二部分. His Pull-down寻找HPPCn相互作用膜蛋白 | 第36-43页 |
一、实验材料 | 第36-37页 |
1. 主要试剂 | 第36页 |
2. 主要仪器 | 第36页 |
3. 所需试剂的配置 | 第36-37页 |
二、实验方法 | 第37-38页 |
1. 置换缓冲体系 | 第37页 |
2. 带His标签的HPPCn与SMMC7721 细胞膜蛋白的交联 | 第37页 |
3. 交联复合体的纯化 | 第37-38页 |
4. 交联复合体的鉴定 | 第38页 |
5. 交联复合体质谱分析 | 第38页 |
三、实验结果 | 第38-41页 |
1. 缓冲体系的置换 | 第38页 |
2. 交联复合体的鉴定 | 第38-40页 |
3. 交联复合体切胶质谱鉴定 | 第40-41页 |
四、讨论 | 第41-43页 |
第三部分. 角蛋白8/18 与HPPCn相互作用的验证 | 第43-69页 |
一、实验材料 | 第43-45页 |
1. 细胞培养 | 第43页 |
2. 菌株及质粒载体 | 第43-44页 |
3. 酶 | 第44页 |
4. 主要试剂 | 第44-45页 |
5. 引物设计 | 第45页 |
二、实验方法 | 第45-57页 |
1. 二步法细胞免疫组化确定角蛋白8/18 的细胞定位 | 第45-46页 |
2. PVDF膜蛋白结合实验 | 第46-47页 |
3. 免疫共沉淀验证角蛋白8/18 与HPPCn的相互作用 | 第47-49页 |
4. 角蛋白8/18 的真核表达载体pCDNA3.1-K8-IRES-K18 的构建 | 第49-55页 |
5. 质粒稳定转染细胞株的筛选 | 第55-57页 |
6. MTT法检测rhHPPCn对转染细胞增殖活性的影响 | 第57页 |
三、实验结果 | 第57-65页 |
1. 二步法免疫组化确定角蛋白8/18 的细胞定位 | 第57-58页 |
2. PVDF膜蛋白结合实验 | 第58页 |
3. 免疫共沉淀验证角蛋白8/18 与HPPCn的相互作用 | 第58-60页 |
4. 角蛋白8/18 的真核表达载体pCDNA3.1-K8-IRES-K18 的构建 | 第60-63页 |
5. 四个质粒稳定转染细胞株的筛选 | 第63-64页 |
6. MTT法检测rhHPPCn对转染细胞增殖活性的影响 | 第64-65页 |
四、讨论 | 第65-69页 |
结论 | 第69-70页 |
参考文献 | 第70-72页 |
综述 角蛋白 8/18 与肝脏损伤及修复 | 第72-81页 |
个人简历 | 第81-82页 |
致谢 | 第82页 |