| 致谢 | 第1-12页 |
| 英文缩略词 | 第12-14页 |
| 摘要 | 第14-16页 |
| Abstract | 第16-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-37页 |
| ·耐高渗HOG途径 | 第20-23页 |
| ·HOG途径信号传导 | 第20-21页 |
| ·HOG途径的上游分支 | 第21-22页 |
| ·Pbs2p与Hog1p的激活 | 第22页 |
| ·HOG途径转录调控机制 | 第22-23页 |
| ·耐高温HSR途径 | 第23-26页 |
| ·热激因子HSF | 第23-24页 |
| ·热激蛋白HSP | 第24-25页 |
| ·分子伴侣功能 | 第25-26页 |
| ·热激蛋白在其它应激途径中的作用 | 第26页 |
| ·应激GSR途径 | 第26-29页 |
| ·鸟苷酸交换因子Cdc25p | 第27页 |
| ·小G蛋白Ras | 第27-28页 |
| ·腺苷环化酶Cyr1p及环化酶相关蛋白 | 第28页 |
| ·蛋白激酶A(PKA) | 第28-29页 |
| ·转录因子Msn2/4p | 第29页 |
| ·海藻糖 | 第29-34页 |
| ·海藻糖的概述 | 第29-30页 |
| ·海藻糖的代谢途径 | 第30-32页 |
| ·海藻糖的合成途径 | 第30-31页 |
| ·海藻糖的分解途径 | 第31-32页 |
| ·海藻糖的保护机制 | 第32-34页 |
| ·"水替代"假说 | 第33页 |
| ·"优先结合"假说 | 第33页 |
| ·"玻璃态"假说 | 第33-34页 |
| ·海藻糖与分子伴侣协同作用理论 | 第34页 |
| ·总结与展望 | 第34页 |
| ·本研究的研究目的与研究内容 | 第34-37页 |
| 第二章 海藻糖代谢途径基因改造工程菌株构建 | 第37-81页 |
| ·前言 | 第37-38页 |
| ·材料 | 第38-43页 |
| ·菌株和质粒 | 第38页 |
| ·主要试剂 | 第38-39页 |
| ·培养基、试剂及缓冲液的配制 | 第39-43页 |
| ·培养基的配制 | 第39-40页 |
| ·试剂及缓冲液配制 | 第40-43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-56页 |
| ·单倍体亲株获得 | 第43-46页 |
| ·二倍体亲株产孢分离单倍体菌株 | 第43-44页 |
| ·单倍体菌株交配型鉴定 | 第44页 |
| ·高糖YEPD培养基发酵工艺 | 第44-45页 |
| ·发酵液组分分析 | 第45页 |
| ·酵母胞内海藻糖含量测定 | 第45-46页 |
| ·标准曲线绘制 | 第45页 |
| ·海藻糖含量的测定 | 第45-46页 |
| ·统计学方法 | 第46页 |
| ·构建重组质粒 | 第46-52页 |
| ·小量质粒提取 | 第46-47页 |
| ·酵母小量基因组DNA抽提 | 第47页 |
| ·聚合酶链式反应 | 第47-48页 |
| ·PCR产物回收 | 第48页 |
| ·质粒及回收产物的酶切 | 第48-49页 |
| ·酶切产物电泳割胶回收 | 第49-50页 |
| ·DNA与质粒的连接 | 第50页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第50页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第50-51页 |
| ·转化子的挑选及鉴定 | 第51-52页 |
| ·菌落PCR | 第51页 |
| ·质粒酶切验证 | 第51-52页 |
| ·测序验证 | 第52页 |
| ·酵母工程菌株构建 | 第52-53页 |
| ·同源重组转化酵母 | 第52页 |
| ·酵母菌落PCR验证 | 第52-53页 |
| ·去除抗性标记 | 第53页 |
| ·海藻糖代谢途径相关酶活测定 | 第53-56页 |
| ·海藻糖-6磷酸合成酶酶活测定 | 第53-54页 |
| ·粗酶液提取 | 第53页 |
| ·BCA法测总蛋白含量 | 第53-54页 |
| ·Tps1p酶活测定 | 第54页 |
| ·海藻糖酸性水解酶酶活测定 | 第54-56页 |
| ·酵母细胞总蛋白提取 | 第54-55页 |
| ·Ath1p酶活测定 | 第55-56页 |
| ·海藻糖中性水解酶酶活测定 | 第56页 |
| ·结果 | 第56-78页 |
| ·单倍体菌株的分离 | 第56页 |
| ·单倍体菌株交配型鉴定 | 第56-57页 |
| ·菌株发酵性能与胞内海藻糖含量相关性分析 | 第57-59页 |
| ·酿酒酵母TPS1过表达菌株构建 | 第59-70页 |
| ·pUG6质粒改进 | 第59页 |
| ·PGK强启动子导入 | 第59-62页 |
| ·构建TPS1过表达载体 | 第62-66页 |
| ·酵母菌株TPS1过表达 | 第66-68页 |
| ·Tps1p酶活测定结果 | 第68-69页 |
| ·KanMX抗性标记去除 | 第69-70页 |
| ·敲除海藻糖水解酶基因酿酒酵母菌株的构建 | 第70-76页 |
| ·待敲除基因的扩增 | 第70-71页 |
| ·pUG6-zeocin质粒的构建 | 第71页 |
| ·基因敲除阻断盒的构建 | 第71-72页 |
| ·PCR介导基因破坏法敲除ATH1/NTH1 | 第72-74页 |
| ·敲除菌株去除抗性标记 | 第74页 |
| ·Ath1p酶活测定结果 | 第74-75页 |
| ·Nth1p酶活测定结果 | 第75-76页 |
| ·工程菌株胞内海藻糖含量测定 | 第76-78页 |
| ·讨论 | 第78-80页 |
| ·不可鉴定交配型单倍体 | 第78页 |
| ·单倍体菌株多样性 | 第78页 |
| ·海藻糖含量与发酵性能相关性 | 第78页 |
| ·工程菌株构建 | 第78-79页 |
| ·抗性标记筛选转化子 | 第79-80页 |
| ·本章小结 | 第80-81页 |
| 第三章 工程菌株与亲株胁迫条件下生长及发酵性能比较 | 第81-105页 |
| ·前言 | 第81-82页 |
| ·材料 | 第82-85页 |
| ·菌株 | 第82-83页 |
| ·主要试剂 | 第83页 |
| ·主要培养基 | 第83页 |
| ·发酵培养基制备 | 第83页 |
| ·主要溶液配制 | 第83-84页 |
| ·仪器 | 第84-85页 |
| ·方法 | 第85-87页 |
| ·不同胁迫条件下生长曲线测定 | 第85页 |
| ·单倍体杂交获得优良二倍体杂合子 | 第85页 |
| ·平板点样 | 第85-86页 |
| ·完全合成培养基发酵工艺 | 第86页 |
| ·玉米糖化醪同步糖化发酵 | 第86页 |
| ·发酵液组分分析 | 第86-87页 |
| ·海藻糖含量测定 | 第87页 |
| ·统计学方法 | 第87页 |
| ·实验结果 | 第87-101页 |
| ·生长曲线测定 | 第87-89页 |
| ·二倍体工程菌株构建 | 第89-90页 |
| ·平板点样 | 第90-91页 |
| ·完全合成培养基发酵 | 第91-98页 |
| ·常糖发酵 | 第91-92页 |
| ·高糖发酵 | 第92-93页 |
| ·高温常糖发酵 | 第93页 |
| ·低pH常糖发酵 | 第93-98页 |
| ·玉米糖化醪发酵 | 第98-101页 |
| ·讨论 | 第101-103页 |
| ·敲除ATH1提高菌株发酵性能 | 第101-102页 |
| ·敲除NTH1菌株高糖下生长能力下降 | 第102页 |
| ·二倍体工程菌株的优良性状 | 第102页 |
| ·海藻糖代谢能量无效循环 | 第102-103页 |
| ·发酵过程中的乙醇胁迫 | 第103页 |
| ·本章小结 | 第103-105页 |
| 第四章 海藻糖代谢工程菌株抗逆性高于亲株的原因初探 | 第105-122页 |
| ·前言 | 第105-106页 |
| ·材料 | 第106-108页 |
| ·菌株 | 第106页 |
| ·主要试剂 | 第106-107页 |
| ·主要溶液及培养基的配制 | 第107页 |
| ·主要仪器 | 第107-108页 |
| ·方法 | 第108-110页 |
| ·平板点样及生长曲线测定 | 第108页 |
| ·平板点样 | 第108页 |
| ·生长曲线绘制 | 第108页 |
| ·呼吸缺陷型检出 | 第108页 |
| ·细胞膜完整性分析 | 第108-109页 |
| ·胞内活性氧(ROS)水平分析 | 第109页 |
| ·酶液提取 | 第109页 |
| ·超氧化物歧化酶(SOD)酶活测定 | 第109-110页 |
| ·数据分析 | 第110页 |
| ·结果 | 第110-119页 |
| ·工程菌株与亲株对乙醇耐受力比较 | 第110-114页 |
| ·工程菌株与亲株乙醇胁迫下生长状况比较 | 第110-112页 |
| ·工程菌株与亲株呼吸缺陷型比例分析比较 | 第112页 |
| ·乙醇胁迫下细胞膜完整性分析 | 第112-114页 |
| ·高渗、高温、低pH等条件下细胞膜完整性分析 | 第114-115页 |
| ·工程菌株与亲株胞内活性氧ROS水平分析比较 | 第115-117页 |
| ·工程菌株与亲株抗氧化性能比较 | 第117-118页 |
| ·工程菌株与亲株SOD活性测定比较 | 第118-119页 |
| ·讨论 | 第119-120页 |
| ·本章小结 | 第120-122页 |
| 第五章 酵母菌HOG信号途径基因的变异及其进化机制研究 | 第122-145页 |
| ·前言 | 第122-123页 |
| ·材料 | 第123-124页 |
| ·菌株 | 第123-124页 |
| ·试剂 | 第124页 |
| ·主要培养基 | 第124页 |
| ·主要仪器 | 第124页 |
| ·实验方法 | 第124-131页 |
| ·黄酒酵母单倍体菌株分离 | 第124-125页 |
| ·平板点样 | 第125页 |
| ·酵母基因组提取 | 第125页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR反应) | 第125-126页 |
| ·引物合成 | 第125页 |
| ·PCR扩增 | 第125-126页 |
| ·电泳验证 | 第126页 |
| ·TA克隆 | 第126-128页 |
| ·PCR产物电泳割胶回收 | 第126页 |
| ·感受态细胞制备 | 第126页 |
| ·与T载体连接 | 第126-127页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第127页 |
| ·白色菌落PCR验证 | 第127-128页 |
| ·酵母基因组中HOG途径基因的确定 | 第128-129页 |
| ·酿酒酵母HOG途径基因多态性分析 | 第129页 |
| ·序列比对及建树 | 第129-130页 |
| ·进化速率的计算及正向进化检测 | 第130页 |
| ·数据分析 | 第130-131页 |
| ·结果 | 第131-141页 |
| ·酿酒酵母种内渗透压耐性差异分析 | 第131页 |
| ·酿酒酵母种内HOG途径基因多态性分析 | 第131-135页 |
| ·HOG途径基因在酵母基因组中的分布 | 第135-137页 |
| ·酵母菌种间基因序列差异与基因功能相关分析 | 第137-138页 |
| ·自然选择压力与基因在途径中位置的相关分析 | 第138-139页 |
| ·其它影响HOG途径基因进化的因素 | 第139-141页 |
| ·讨论 | 第141-143页 |
| ·工业菌株与实验菌株海藻糖合成量不同 | 第141-142页 |
| ·不同酿酒酵母种内HOG途径基因的差异 | 第142页 |
| ·不同酵母种间HOG途径基因的差异 | 第142-143页 |
| ·全基因组网络分析 | 第143页 |
| ·本章小结 | 第143-145页 |
| 第六章 全文总结及后续工作建议 | 第145-149页 |
| ·全文总结 | 第145-147页 |
| ·本文创新点 | 第147页 |
| ·后续工作建议 | 第147-149页 |
| 参考文献 | 第149-156页 |
| 附录 | 第156-157页 |
| 作者简历 | 第157页 |
