| 名词缩写 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 综述 | 第10-20页 |
| 1 重组工程 | 第10-12页 |
| 1.1 重组工程概述 | 第10页 |
| 1.2 重组工程的作用机理 | 第10-11页 |
| 1.3 重组工程研究进展 | 第11-12页 |
| 2 点突变 | 第12-13页 |
| 3 谷氨酸棒状杆菌 | 第13页 |
| 4 Cre/loxP系统 | 第13-15页 |
| 5 I-SceI | 第15页 |
| 6 CRISPR/Cas9 | 第15-19页 |
| 6.1 CRISPR/Cas的结构 | 第15-17页 |
| 6.2 CRISPR/Cas9系统的作用机制 | 第17-18页 |
| 6.3 CRISPR/Cas9的优缺点 | 第18页 |
| 6.4 CRISPR/Cas9的研究进展 | 第18-19页 |
| 7 N-乙酰-D-神经氨酸 | 第19-20页 |
| 第二章 谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除方法的探索 | 第20-56页 |
| 第一节 重组工程结合I-SceI内切酶介导的重组方法对谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除的探索 | 第20-36页 |
| 1 实验材料 | 第20-26页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第20-22页 |
| 1.2 引物及测序 | 第22-25页 |
| 1.3 溶液的配制 | 第25-26页 |
| 1.4 主要使用的工具酶及各种试剂 | 第26页 |
| 1.5 主要的实验仪器设备 | 第26页 |
| 2 实验方法 | 第26-30页 |
| 2.1 常规的分子生物学操作方法 | 第26-28页 |
| 2.2 大肠杆菌DH10B的感受态细胞制备及DNA转化方法 | 第28-29页 |
| 2.3 质粒的提取 | 第29页 |
| 2.4 C.glutamicum ATCC 13032电转感受态及含有重组质粒的C.glutamicum ATCC 13032 Red电转感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| 3 质粒构建 | 第30-31页 |
| 3.1 由阿拉伯糖诱导重组的含Pbad- I-SceI基因的质粒构建 | 第30-31页 |
| 3.2 由IPTG诱导的含recET重组酶基因和新RBS I-SceI载体的质粒构建 | 第31页 |
| 4 实验结果 | 第31-36页 |
| 第二节 长同源片段的重组质粒对C. glutamicum ATCC中crtI2基因进行敲除 | 第36-45页 |
| 1 质粒构建 | 第36-37页 |
| 1.1 含有0.5 kb同源臂的质粒构建 | 第36页 |
| 1.2 含有1.0 kb同源臂的质粒构建 | 第36-37页 |
| 2 实验结果 | 第37-45页 |
| 第三节 IPTG诱导的含recT-cas9基因的质粒应用于 C.glutamicum ATCC 13032 | 第45-51页 |
| 1 质粒构建 | 第45-46页 |
| 1.1 构建含recT与cas9基因的系列质粒 | 第45页 |
| 1.2 构建含upp-sgRNA的不同启动子(Peftu、Psod、Ptac)的质粒 | 第45-46页 |
| 2 实验结果 | 第46-51页 |
| 第四节 使用重组工程结合Cre/loxP系统对C.glutamicum ATCC 13032进行基因敲除 | 第51-56页 |
| 1 质粒构建 | 第51-52页 |
| 2 实验结果 | 第52-56页 |
| 第三章 重组工程介导的定点突变 | 第56-68页 |
| 1 实验材料 | 第57-59页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第57-58页 |
| 1.2 引物和测序 | 第58-59页 |
| 2 实验方法 | 第59-61页 |
| 2.1 Red电转化感受态细胞的制备 | 第59页 |
| 2.2 以构建的重组菌株进行诱导重组酶表达的重组体系 | 第59-61页 |
| 3 S208G、E192五个位点的系列实验 | 第61-63页 |
| 3.1 S208G-5C五个位点的点突变 | 第61-62页 |
| 3.2 E192 RSM-5C五个位点的点饱和突变 | 第62页 |
| 3.3 不同长度的同源臂对S208G-5C突变效率的影响 | 第62页 |
| 3.4 连续7个摆动位点的碱基突变与基于质粒的Red系统进行重组工程介导的突变 | 第62-63页 |
| 4 实验结果 | 第63-68页 |
| 总结 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第79页 |
