| 致谢 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| abstract | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第18-27页 |
| 1.1 右旋糖酐概述 | 第18页 |
| 1.1.1 右旋糖酐简介 | 第18页 |
| 1.1.2 右旋糖酐的应用 | 第18页 |
| 1.2 右旋糖酐蔗糖酶 | 第18-22页 |
| 1.2.1 右旋糖酐蔗糖酶产生菌 | 第19页 |
| 1.2.2 右旋糖酐蔗糖酶的结构 | 第19-21页 |
| 1.2.3 右旋糖酐蔗糖酶的催化机制 | 第21页 |
| 1.2.4 右旋糖酐蔗糖酶的分子改造现状 | 第21-22页 |
| 1.3 热稳定性研究 | 第22-25页 |
| 1.3.1 酶的热稳定性概述 | 第22页 |
| 1.3.2 提高热稳定性的途径 | 第22-25页 |
| 1.4 课题研究意义 | 第25页 |
| 1.5 研究内容和思路 | 第25-27页 |
| 第二章 右旋糖酐蔗糖酶基因的定点及迭代突变 | 第27-39页 |
| 2.1 引言 | 第27-28页 |
| 2.2 实验用品 | 第28-30页 |
| 2.2.1 试剂 | 第28-29页 |
| 2.2.2 仪器 | 第29页 |
| 2.2.3 质粒与菌株 | 第29页 |
| 2.2.4 培养基 | 第29-30页 |
| 2.2.5 配制相关试剂 | 第30页 |
| 2.3 实验方法 | 第30-35页 |
| 2.3.1 同源建模 | 第30页 |
| 2.3.2 定点突变 | 第30-31页 |
| 2.3.3 引物设计 | 第31-32页 |
| 2.3.4 提取重组质粒 | 第32-33页 |
| 2.3.5 PCR扩增 | 第33-34页 |
| 2.3.6 消化PCR产物 | 第34页 |
| 2.3.7 转化 | 第34页 |
| 2.3.8 突变质粒提取及菌液PCR | 第34-35页 |
| 2.4 结果与分析 | 第35-38页 |
| 2.4.1 右旋糖酐蔗糖酶模型的建立及突变位点的选择 | 第35-36页 |
| 2.4.2 突变基因的构建 | 第36-37页 |
| 2.4.3 突变质粒提取及菌液PCR验证结果 | 第37-38页 |
| 2.5 小结 | 第38-39页 |
| 第三章 耐热型突变株的筛选及其热稳定性研究 | 第39-55页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 实验用品 | 第39-43页 |
| 3.2.1 试剂 | 第39-40页 |
| 3.2.2 仪器 | 第40-41页 |
| 3.2.3 菌种 | 第41页 |
| 3.2.4 培养基 | 第41页 |
| 3.2.5 配制相关溶液 | 第41-43页 |
| 3.3 实验方法 | 第43-46页 |
| 3.3.1 重组质粒的转化 | 第43页 |
| 3.3.2 突变体重组蛋白的表达及制备 | 第43-44页 |
| 3.3.3 DNS法测定酶活力 | 第44页 |
| 3.3.4 酶的最适反应pH值及pH稳定性 | 第44-45页 |
| 3.3.5 酶的最适反应温度及热稳定性研究 | 第45页 |
| 3.3.6 右旋糖酐的合成 | 第45页 |
| 3.3.7 核磁共振(NMR)分析产物的键型比例 | 第45页 |
| 3.3.8 动力学研究 | 第45-46页 |
| 3.4 结果与分析 | 第46-53页 |
| 3.4.1 野生型右旋糖酐蔗糖酶及其突变酶的活性 | 第46-47页 |
| 3.4.2 最适pH值及pH稳定性 | 第47-49页 |
| 3.4.3 最适反应温度及热稳定性研究 | 第49-52页 |
| 3.4.4 动力学分析 | 第52页 |
| 3.4.5 分析产物糖苷键的比例 | 第52-53页 |
| 3.5 小结 | 第53-55页 |
| 第四章 二硫键对右旋糖酐蔗糖酶热稳定性的初步研究 | 第55-70页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 实验用品 | 第55-57页 |
| 4.2.1 试剂 | 第55-56页 |
| 4.2.2 仪器 | 第56-57页 |
| 4.2.3 质粒及菌种 | 第57页 |
| 4.2.4 培养基 | 第57页 |
| 4.2.5 相关溶液的配制 | 第57页 |
| 4.3 实验方法 | 第57-63页 |
| 4.3.1 二硫键的预测 | 第57-59页 |
| 4.3.2 引入二硫键的原则 | 第59页 |
| 4.3.3 迭代突变法 | 第59页 |
| 4.3.4 引物设计 | 第59-61页 |
| 4.3.5 重组质粒提取 | 第61页 |
| 4.3.6 PCR扩增及产物消化 | 第61页 |
| 4.3.7 PCR产物的纯化 | 第61页 |
| 4.3.9 转化 | 第61-62页 |
| 4.3.10 突变质粒的提取及双酶切验证 | 第62页 |
| 4.3.11 突变体重组蛋白的表达及制备 | 第62页 |
| 4.3.12 酶活的测定 | 第62页 |
| 4.3.13 突变酶的热稳定性研究 | 第62-63页 |
| 4.3.14 突变酶产物的特异性研究 | 第63页 |
| 4.4 结果与分析 | 第63-69页 |
| 4.4.1 引入二硫键的选择 | 第63-64页 |
| 4.4.2 定点突变构建二硫键 | 第64页 |
| 4.4.3 突变质粒提取及双酶切验证结果 | 第64-65页 |
| 4.4.4 突变体的表达及酶活性测定 | 第65-66页 |
| 4.4.5 二硫键对热稳定性的研究 | 第66-67页 |
| 4.4.6 突变体产物的特异性研究 | 第67-69页 |
| 4.5 小结 | 第69-70页 |
| 第五章 软件模拟分析突变模型 | 第70-77页 |
| 5.1 引言 | 第70页 |
| 5.2 实验材料 | 第70页 |
| 5.2.1 供试材料 | 第70页 |
| 5.2.2 生物模拟软件 | 第70页 |
| 5.3 实验方法 | 第70-72页 |
| 5.3.1 模型中氨基酸的突变 | 第70-71页 |
| 5.3.2 突变体P473S/P856S中氢键的分析 | 第71页 |
| 5.3.3 突变成Cys形成二硫键 | 第71页 |
| 5.3.4 突变体中二硫键及氢键的分析 | 第71页 |
| 5.3.5 PyMOL作图 | 第71-72页 |
| 5.4 实验结果与分析 | 第72-75页 |
| 5.3.1 对突变酶P473S/P856S的结构分析 | 第72-74页 |
| 5.3.2 引入二硫键突变体的结构分析 | 第74-75页 |
| 5.5 小结 | 第75-77页 |
| 第六章 结论与展望 | 第77-79页 |
| 6.1 结论 | 第77页 |
| 6.2 展望 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-87页 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 | 第87-88页 |
