| 摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 前言 | 第13-17页 |
| 第一部分 CIK诱导培养过程中TCR表达谱的变化研究 | 第17-29页 |
| 引言 | 第17页 |
| 1.1 材料 | 第17-19页 |
| 1.2 实验方法 | 第19-23页 |
| 1.2.1 实验标本的收集 | 第19页 |
| 1.2.2 PBMC细胞的分离 | 第19页 |
| 1.2.3 CIK细胞的诱导培养 | 第19-20页 |
| 1.2.4 流式细胞术（FCM）检测CD3、CD4、CD8、CD56 比例 | 第20页 |
| 1.2.5 流式分选目的细胞群 | 第20页 |
| 1.2.6 分选细胞RNA的提取 | 第20-21页 |
| 1.2.7 第一链cDNA的合成 | 第21-22页 |
| 1.2.8 GEXP上机检测TCR Vβ CDR3 谱型及长度 | 第22-23页 |
| 1.3 结果 | 第23-28页 |
| 1.3.1 0 天、7 天和14天CIK细胞的形态学观察 | 第23页 |
| 1.3.2 0 天、7 天和14天CIK各细胞群比例及流式分选后纯度测定 | 第23-24页 |
| 1.3.3 多重PCR扩增TCRVβ 片段CDR3 区电泳结果 | 第24页 |
| 1.3.4 GEXP分析TCRVβ 片段CDR3 区域多态性的差异性 | 第24-28页 |
| 小结 | 第28-29页 |
| 第二部分 CIK细胞转染特异性TCR后杀伤功能变化的研究 | 第29-33页 |
| 引言 | 第29页 |
| 2.1 材料 | 第29页 |
| 2.2 方法 | 第29-31页 |
| 2.2.1 HEK293 细胞的复苏与培养 | 第29-30页 |
| 2.2.2 重组腺病毒Ad5/F35. pDC315-TCRVα4-IRES-Vβ7 的大量扩增 | 第30页 |
| 2.2.3 TCID50 方法测定病毒滴度 | 第30页 |
| 2.2.4 重组腺病毒感染培养7天的CIK细胞 | 第30页 |
| 2.2.5 流式检测感染CIK细胞TCR表达水平的变化 | 第30-31页 |
| 2.2.6 钙黄绿素(Calcein-AM)法检测感染特异性TCR的CIK细胞杀伤功能的验证 | 第31页 |
| 2.3 结果 | 第31-33页 |
| 2.3.1 扩增后收获的重组腺病毒滴度测定 | 第31页 |
| 2.3.2 流式检测经重组腺病毒感染的CIK细胞TCR表达水平的变化 | 第31-32页 |
| 2.3.3 钙黄绿素(Calcein-AM)法检测感染特异性TCR的CIK细胞杀伤功能的验证 | 第32-33页 |
| 小结 | 第33页 |
| 第三部分 7402-TCR-YFP稳转系的建立 | 第33-43页 |
| 引言 | 第33页 |
| 3.1 材料 | 第33-34页 |
| 3.2 方法 | 第34-38页 |
| 3.2.1 cDNA3.1-TCR-YFP克隆质粒的构建过程 | 第34-37页 |
| 3.2.2 pcDNA3.1-TCR-YFP质粒的线性化 | 第37页 |
| 3.2.3 7402 转pcDNA3.1-TCR-YFP稳转系的构建及单克隆的筛选 | 第37-38页 |
| 3.3 结果 | 第38-42页 |
| 3.3.1 构建cDNA3.1-TCR-YFP重组质粒 | 第38-39页 |
| 3.3.2 重组质粒序列测定 | 第39页 |
| 3.3.3 去内毒素cDNA3.1-TCR-YFP重组质粒的提取和Mfe I酶切线性化 | 第39页 |
| 3.3.4 7402 最佳G418 筛选浓度的确定 | 第39-40页 |
| 3.3.5 稳转7402细胞的筛选及荧光效率检测 | 第40-41页 |
| 3.3.6 单克隆细胞系的筛选及荧光效率检测 | 第41-42页 |
| 小结 | 第42-43页 |
| 第四部分 CRISPR-Cas9-TCRBC敲除质粒的构建及其敲除功能的验证 | 第43-56页 |
| 引言 | 第43-44页 |
| 4.1 材料 | 第44页 |
| 4.2 方法 | 第44-49页 |
| 4.2.1 sgRNA靶位点设计以及寡核苷酸链合成 | 第44-45页 |
| 4.2.2 PX330-sgRNA、PX458-sgRNA敲除质粒的构建 | 第45-47页 |
| 4.2.3 PX330-TCRBC敲除质粒功能的验证 | 第47页 |
| 4.2.4 敲除质粒PX458-S对HepG2 细胞系敲除效率的验证 | 第47-49页 |
| 4.3 结果 | 第49-56页 |
| 4.3.1 PX330-91、PX330-93、PX330-S、PX458-S、PX458-91、PX458-93 敲除质粒的构建 | 第49-50页 |
| 4.3.2 流式检测PX330-91、PX330-93、PX330-S转染 7402-TCR-YFP细胞的荧光变化 | 第50-52页 |
| 4.3.3 PX458-S、PX458-91、PX458-93 质粒对HepG2 细胞系的转染效率 | 第52-53页 |
| 4.3.4 PX458-S、PX458-91、PX458-93 对Hep G2 细胞系的敲除效率验证 | 第53-56页 |
| 小结 | 第56页 |
| 讨论 | 第56-61页 |
| 参考文献 | 第61-67页 |
| 附录一 英文缩略词表 | 第67-69页 |
| 附录二 质粒图谱 | 第69-71页 |
