| 创新点 | 第12-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-16页 |
| 技术路线 | 第17-18页 |
| 第一部分 文献综述 | 第18-33页 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒的研究进展 | 第18-21页 |
| 1 IBDV 简介 | 第18页 |
| 2 IBDV 的基因组结构 | 第18页 |
| 3 IBDV 各蛋白功能 | 第18-21页 |
| 第二章 自噬的研究进展 | 第21-33页 |
| 1 细胞自噬 | 第21页 |
| 2 细胞自噬的分子机制 | 第21-23页 |
| 2.1 诱导 | 第22页 |
| 2.2 自噬泡的成核和生长 | 第22-23页 |
| 2.3 Atg9 膜系统的循环 | 第23页 |
| 2.4 自噬泡与溶酶体或液泡的融合，内含物的释放和降解 | 第23页 |
| 3 自噬与细胞信号途径 | 第23-25页 |
| 3.1 营养信号 | 第24页 |
| 3.2 胰岛素/生长因子信号途径 | 第24页 |
| 3.3 能量感应 | 第24-25页 |
| 3.4 压力反应 | 第25页 |
| 4. 自噬与病毒 | 第25-33页 |
| 4.1 自噬与免疫 | 第25-27页 |
| 4.1.1 自噬在先天免疫中的作用 | 第25-26页 |
| 4.1.1.1 直接降解胞内的病毒 | 第25-26页 |
| 4.1.1.2 促进模式识别分子的识别 | 第26页 |
| 4.1.1.3 调节炎症反应 | 第26页 |
| 4.1.2 自噬在获得性免疫中的作用 | 第26-27页 |
| 4.2 自噬利于病毒的复制 | 第27-28页 |
| 4.3 病毒对自噬的影响 | 第28-30页 |
| 4.3.1 抑制自噬泡的形成 | 第28页 |
| 4.3.2 阻止自噬泡的成熟 | 第28-30页 |
| 4.4 病毒受体与自噬 | 第30-33页 |
| 第二部分 研究内容 | 第33-110页 |
| 第一章 IBDV 对宿主细胞自噬的影响 | 第33-53页 |
| 1. 材料方法 | 第35-39页 |
| 1.1 病毒与细胞 | 第35页 |
| 1.2 试剂和抗体 | 第35页 |
| 1.3 蛋白样品收集 | 第35页 |
| 1.4 蛋白浓度的测定 | 第35-36页 |
| 1.5 免疫共沉淀 | 第36页 |
| 1.6 透射电镜 | 第36-37页 |
| 1.7 免疫荧光 | 第37页 |
| 1.8 GFP-LC3 标记自噬体的检测 | 第37-38页 |
| 1.9 SDS-PAGE 及 Western-blot | 第38页 |
| 1.10 IBDV 病毒的氯化铯密度梯度离心纯化 | 第38-39页 |
| 1.11 绿色荧光真核表达载体 peGFP-LC3 载体的构建 | 第39页 |
| 1.11.1 引物设计与合成 | 第39页 |
| 1.11.2 LC3 基因的扩增和克隆 | 第39页 |
| 2. 实验结果 | 第39-51页 |
| 2.1 IBDV 感染对内源性 LC3 以及 P62 的影响 | 第39-41页 |
| 2.2 纯化病毒对 DF-1 细胞内源性 LC3 的影响 | 第41-42页 |
| 2.3 IBDV 感染对 GFP-LC3 的影响 | 第42-46页 |
| 2.4 自噬对病毒的影响 | 第46-51页 |
| 2.4.1 自噬泡对病毒的包裹 | 第46-47页 |
| 2.4.2 自噬泡对病毒蛋白的包裹 | 第47-48页 |
| 2.4.3 抑制自噬和增强自噬对病毒复制的影响 | 第48-51页 |
| 3. 讨论 | 第51-53页 |
| 第二章 Hsp90 识别 IBDV 并促进细胞自噬 | 第53-74页 |
| 1. 材料方法 | 第54-55页 |
| 1.1 western blot | 第54页 |
| 1.2 蛋白原核表达 | 第54-55页 |
| 1.2.1 大肠杆菌的诱导表达 | 第54页 |
| 1.2.2 大肠杆菌的裂解 | 第54-55页 |
| 1.3 真核表达载体 Myc-Hsp90 和 Flag-AKT 载体的构建 | 第55页 |
| 1.3.1 引物设计与合成 | 第55页 |
| 1.3.2 Hsp90 基因的扩增和克隆 | 第55页 |
| 2.实验结果 | 第55-71页 |
| 2.1 IBDV 在感染前期抑制宿主细胞中 AKT 和 mTOR 的磷酸化 | 第55-57页 |
| 2.2 IBDV 在感染早期对自噬的激活依赖于 mTOR 通路 | 第57-58页 |
| 2.3 IBDV VP2 蛋白可以诱导细胞自噬的发生 | 第58-61页 |
| 2.4 IBDV 通过细胞表面受体 Hsp90 抑制 AKT/mTOR 活性，并因此来激活自 噬 | 第61-71页 |
| 2.4.1 VP2 能够与 Hsp90 互作 | 第62-63页 |
| 2.4.2 IBDV 感染与 VP2 孵育能够导致 AKT 和 Hsp90 互作的变弱 | 第63-64页 |
| 2.4.3 VP2 与细胞 Hsp90 的互作对于自噬的诱导是必须的 | 第64-65页 |
| 2.3.4 IBDV/VP2 对 AKT/mTOR 通路的影响始于细胞膜处 | 第65页 |
| 2.4.5 Hsp90 抗体能够促进细胞自噬 | 第65-67页 |
| 2.4.6 Hsp90 抗体能够抑制 AKT/mTOR 信号通路的活性 | 第67页 |
| 2.4.7 Hsp90,AKT,mTOR 对于 IBDV 感染和 VP2 孵育所激活的自噬是必需的 | 第67-71页 |
| 2.5 IBDV 入侵细胞激活自噬模式图 | 第71页 |
| 3.讨论 | 第71-74页 |
| 3.1 IBDV 和病原受体 | 第71-72页 |
| 3.2 mTOR 和模式识别分子的检测 | 第72-74页 |
| 第三章 IBDV VP3 抑制细胞自噬 | 第74-110页 |
| 1.材料与方法 | 第75-77页 |
| 1.1 病毒与细胞 | 第75页 |
| 1.2 试剂和抗体 | 第75-76页 |
| 1.3 蛋白样品收集 | 第76页 |
| 1.4 蛋白浓度的测定 | 第76页 |
| 1.5 免疫共沉淀 | 第76页 |
| 1.6 真核表达载体 Myc-Hsp90 和 Flag-AKT 载体的构建 | 第76-77页 |
| 1.6.1 引物设计与合成 | 第76页 |
| 1.6.2 基因的扩增和克隆 | 第76-77页 |
| 2.实验结果 | 第77-107页 |
| 2.1 IBDV VP3 结构域缺失突变体的构建 | 第77-79页 |
| 2.2 IBDV 各病毒蛋白对 GFP-LC3 的影响 | 第79-83页 |
| 2.2.1 IBDV 各病毒基因和 GFP-LC3 双表达质粒构建 | 第79页 |
| 2.2.2 各病毒基因表达后对宿主细胞 GFP-LC3 的影响 | 第79-80页 |
| 2.2.3 各病毒基因对 GFP-LC3 荧光强度的影响 | 第80-81页 |
| 2.2.4 共转各病毒基因和 GFP-LC3 后对 GFP 荧光强度的影响 | 第81页 |
| 2.2.5 VP3 或 VP5 影响各病毒基因对 GFP-LC3 荧光的影响 | 第81-82页 |
| 2.2.6 western 验证 VP3 影响其他各病毒基因对内源性 LC3 和 P62 的影响65 | 第82-83页 |
| 2.3 IBDV 各病毒基因表达对 293T 细胞中内源性 LC3 及 P62 的影响 | 第83-84页 |
| 2.4 VP3 对 DF-1 细胞自噬泡的影响 | 第84-85页 |
| 2.5 VP3 能够与 DF-1 细胞的 Beclin-1 发生互作 | 第85-87页 |
| 2.6 IBDV 感染的鸡法氏囊组织中，IBDV VP3 能够与内源性的 Beclin-1 发生互 作 | 第87-88页 |
| 2.7 IBDV 感染的 293T 细胞中，IBDV VP3 能够与内源性的 Beclin-1 发生互作 | 第88-89页 |
| 2.8 VP3 CC 结构域缺失突变体与 Beclin-1 互作的分析 | 第89-91页 |
| 2.9 IBDV VP3CC 结构域缺失对自噬的影响 | 第91页 |
| 2.10 IBDV 感染对 Beclin-1-VPS34 复合体的影响 | 第91-92页 |
| 2.11 VP3 对 Beclin-1 与 ATG14 互作的影响 | 第92-94页 |
| 2.12 IBDV 感染对 hBeclin-1-VPS34 复合体的破坏导致 PI3P 形成的减少 | 第94页 |
| 2.13 VP3 诱导 VPS34-AKT-PDK1 复合体的形成 | 第94-97页 |
| 2.13.1 VP3 促进 VPS34 和 PDK1 以及 AKT 的互作 | 第95-96页 |
| 2.13.2 VP3 促进 AKT 和 PDK1 以及 VPS34 的互作 | 第96-97页 |
| 2.14 VP3 无法促进 hBeclin-1 和 AKT 以及 PDK1 的互作 | 第97-98页 |
| 2.15 VP3 促进 AKT 和 mTOR 的磷酸化 | 第98-99页 |
| 2.16 VP3 促进 AKT 的磷酸化依赖于 VPS3482 | 第99-100页 |
| 2.17 PDK1 抑制剂能够逆反由 VP3 抑制的自噬 | 第100-101页 |
| 2.18 PDK1 抑制剂不能逆反 VP3 对 VPS34 复合体的破坏 | 第101-102页 |
| 2.19 VP3 能够诱导 VPS34 和 AKT 定位 | 第102-103页 |
| 2.20 VP3 能够诱导 VPS34 和 PDK1 的共定位 | 第103-104页 |
| 2.21 VP3 能够诱导内质网（ER）和 AKT 定位 | 第104-105页 |
| 2.22 VP3 能够诱导内质网（ER）和 PDK1 定位 | 第105-106页 |
| 2.23 对 VPS34 和 ER 共定位的验证 | 第106-107页 |
| 2.24 VP3 抑制自噬模式图 | 第107页 |
| 3. 讨论 | 第107-110页 |
| 全文总结 | 第110-113页 |
| 展望 | 第113-117页 |
| 参考文献 | 第117-126页 |
| 第三部分 附录 | 第126页 |
| 附录 A 缩略词 | 第126-128页 |
| 附录 B 常用缓冲液及培养基配方 | 第128-133页 |
| 致谢 | 第133页 |
