| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 目录 | 第8-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-26页 |
| 1.1 淀粉酶概述 | 第13-14页 |
| 1.1.1 淀粉酶的来源 | 第13页 |
| 1.1.2 淀粉酶的分类 | 第13-14页 |
| 1.1.2.1 按产物的异头碳原子的构型分类 | 第13-14页 |
| 1.1.2.2 按生物学来源分类 | 第14页 |
| 1.1.2.3 按作用方式分类 | 第14页 |
| 1.1.2.4 按底物体系粘度进行分类 | 第14页 |
| 1.1.2.5 按产物专一性分类 | 第14页 |
| 1.2 嗜盐微生物概述 | 第14-18页 |
| 1.2.1 嗜盐微生物的生态环境和生理机能 | 第16页 |
| 1.2.2 嗜盐微生物的嗜盐适应机理 | 第16-18页 |
| 1.2.2.1 Na~+依存性 | 第16-17页 |
| 1.2.2.2 酶的盐适应性 | 第17页 |
| 1.2.2.3 嗜盐微生物的质膜、色素和H+泵的作用 | 第17页 |
| 1.2.2.4 排盐作用 | 第17页 |
| 1.2.2.5 细胞内溶质浓度的调节 | 第17-18页 |
| 1.2.2.6 耐盐基因片段 | 第18页 |
| 1.3 嗜盐酶简述 | 第18-22页 |
| 1.3.1 产嗜盐酶的微生物 | 第18-20页 |
| 1.3.1.1 产嗜盐淀粉酶的微生物 | 第19页 |
| 1.3.1.2 嗜盐蛋白酶的微生物 | 第19页 |
| 1.3.1.3 嗜盐木聚糖酶微生物 | 第19页 |
| 1.3.1.4 嗜盐纤维素酶和支链淀粉酶 | 第19页 |
| 1.3.1.5 嗜盐脂肪酶 | 第19-20页 |
| 1.3.1.6 嗜盐几丁质酶,DNA酶,支链淀粉酶,菊粉酶 | 第20页 |
| 1.3.2 嗜盐酶的发展研究 | 第20页 |
| 1.3.3 嗜盐酶的应用 | 第20-21页 |
| 1.3.4 嗜盐酶有关嗜盐特性的研究 | 第21-22页 |
| 1.4 酶分子改造 | 第22-24页 |
| 1.4.1 定点突变 | 第22页 |
| 1.4.2 定向进化 | 第22-23页 |
| 1.4.3 截断表达 | 第23页 |
| 1.4.4 融合表达 | 第23页 |
| 1.4.5 密码子优化 | 第23页 |
| 1.4.6 mRNA结构改造 | 第23-24页 |
| 1.4.7 GC含量调整 | 第24页 |
| 1.5 立题依据及意义 | 第24-25页 |
| 1.6 实验技术路线 | 第25-26页 |
| 第二章 材料和方法 | 第26-36页 |
| 2.1 材料 | 第26-27页 |
| 2.1.1 土样的采集 | 第26页 |
| 2.1.2 菌株和质粒 | 第26页 |
| 2.1.3 主要试剂和酶 | 第26-27页 |
| 2.1.3.1 主要试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.3.2 酶制剂 | 第27页 |
| 2.1.4 各种培养基的配方 | 第27页 |
| 2.1.5 主要的仪器以及设备 | 第27页 |
| 2.2 实验的具体方法及步骤 | 第27-36页 |
| 2.2.1 样品菌体的收集 | 第27页 |
| 2.2.2 菌株的鉴定 | 第27-28页 |
| 2.2.2.1 细菌16SrDNA扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.2.2 菌株的鉴定 | 第28页 |
| 2.2.3 细菌总DNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.4 质粒提取方法 | 第28页 |
| 2.2.5 感受态的制备以及转化 | 第28页 |
| 2.2.6 重组质粒的构建 | 第28-31页 |
| 2.2.6.1 引物设计 | 第28-29页 |
| 2.2.6.2 目的片段PCR扩增 | 第29页 |
| 2.2.6.3 目的片段的双酶切 | 第29-30页 |
| 2.2.6.4 重组质粒的构建 | 第30页 |
| 2.2.6.5 重组质粒转JM1 09 | 第30-31页 |
| 2.2.7 重组质粒的验证 | 第31页 |
| 2.2.7.1 双酶切验证 | 第31页 |
| 2.2.7.2 测序验证 | 第31页 |
| 2.2.8 目的基因的诱导表达 | 第31页 |
| 2.2.9 镍柱亲合层析法纯化目的蛋白 | 第31-32页 |
| 2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 | 第32页 |
| 2.2.11 测定标准曲线 | 第32-33页 |
| 2.2.11.1 蛋白质标准曲线的测定 | 第32页 |
| 2.2.11.2 葡萄糖标准曲线的测定 | 第32-33页 |
| 2.2.12 淀粉酶酶活力的测定 | 第33页 |
| 2.2.13 酶学性质相关研究 | 第33-34页 |
| 2.2.14 HPLC对嗜盐淀粉酶水解淀粉产物的分析 | 第34页 |
| 2.2.15 同源建模及突变位点的选择 | 第34页 |
| 2.2.16 反向PCR介导的定点饱和突变 | 第34-36页 |
| 第三章 结果与分析 | 第36-60页 |
| 3.1 培养菌的淀粉酶活力检测 | 第36页 |
| 3.2 菌株总DNA提取 | 第36页 |
| 3.3 16Sr DNA鉴定 | 第36-37页 |
| 3.4 16Sr DNA PCR产物的连接转化 | 第37-38页 |
| 3.5 阴沟肠杆菌的信号肽预测 | 第38-39页 |
| 3.6 阴沟肠杆菌目的基因的克隆 | 第39-40页 |
| 3.7 重组质粒验证 | 第40页 |
| 3.7.1 双酶切验证 | 第40页 |
| 3.7.2 测序验证 | 第40页 |
| 3.8 目的基因的诱导及表达 | 第40-41页 |
| 3.9 重组酶的酶学性质 | 第41-50页 |
| 3.9.1 嗜盐酶与EDTA螯合后的酶活情况 | 第41-42页 |
| 3.9.2 嗜盐酶在不同缓冲液下的酶活情况 | 第42页 |
| 3.9.3 嗜盐酶在不同溶液中的酶活情况 | 第42-43页 |
| 3.9.4 嗜盐α-淀粉酶的最适温度 | 第43页 |
| 3.9.5 嗜盐α-淀粉酶的最适pH | 第43-44页 |
| 3.9.6 嗜盐α-淀粉酶的最适NaCl浓度 | 第44页 |
| 3.9.7 嗜盐α-淀粉酶的热稳定性 | 第44-45页 |
| 3.9.8 嗜盐α-淀粉酶的pH稳定性 | 第45-46页 |
| 3.9.9 EDTA对嗜盐α-淀粉酶酶活性的影响 | 第46-47页 |
| 3.9.10 Ca~(2+)对嗜盐α-淀粉酶稳定性的影响 | 第47页 |
| 3.9.11 金属离子对嗜盐α-淀粉酶酶活性的影响 | 第47-48页 |
| 3.9.12 嗜盐α-淀粉酶的底物特异性 | 第48页 |
| 3.9.13 HPLC对嗜盐α-淀粉酶水解的淀粉产物分析 | 第48-49页 |
| 3.9.14 嗜盐α-淀粉酶的比活力测定 | 第49-50页 |
| 3.9.15 嗜盐α-淀粉酶的Vmax和Km值 | 第50页 |
| 3.10 嗜盐α-淀粉酶嗜盐机理的研究 | 第50-52页 |
| 3.10.1 突变位点的选择 | 第50-51页 |
| 3.10.2 突变位点418饱和突变 | 第51-52页 |
| 3.10.3 突变氨基酸研究 | 第52页 |
| 3.11 突变酶的酶学性质 | 第52-60页 |
| 3.11.1 突变酶的反向PCR扩增及诱导表达 | 第53-54页 |
| 3.11.2 突变酶最适温度 | 第54-55页 |
| 3.11.2.1 有NaCl情况下的最适温度 | 第54页 |
| 3.11.2.2 无NaCl情况下的最适温度 | 第54-55页 |
| 3.11.3 突变酶最适pH | 第55-56页 |
| 3.11.3.1 在有NaCl情况下的最适pH | 第55-56页 |
| 3.11.3.2 在无NaCl情况下的最适pH | 第56页 |
| 3.11.4 突变酶最适NaCl浓度 | 第56-57页 |
| 3.11.5 突变酶的Vmax和Km值 | 第57-60页 |
| 3.11.5.1 有NaCl情况下的Vmax和Km值 | 第57-58页 |
| 3.11.5.2 无NaCl情况下的Vmax和Km值 | 第58-60页 |
| 第四章 讨论 | 第60-64页 |
| 4.1 嗜盐淀粉酶 | 第60页 |
| 4.2 嗜盐机理的研究 | 第60-64页 |
| 第五章 结论与展望 | 第64-66页 |
| 5.1 结论 | 第64页 |
| 5.2 问题和展望 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-73页 |
| 附录1 | 第73-76页 |
| 附录2 | 第76-79页 |
| 附录3 | 第79-81页 |
| 附录4 | 第81-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 | 第86页 |
