| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略语表 | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第16-27页 |
| 1.1 STEAP4家族及基因特性 | 第16-20页 |
| 1.1.1 STEAP家族的特征 | 第16页 |
| 1.1.2 STEAP4基因结构 | 第16-17页 |
| 1.1.3 STEAP4基因SNPs研究 | 第17-18页 |
| 1.1.4 STEAP4蛋白结构 | 第18页 |
| 1.1.5 STEAP4的细胞定位 | 第18-19页 |
| 1.1.6 STEAP4的金属还原酶活性 | 第19页 |
| 1.1.7 STEAP4的组织分布情况 | 第19-20页 |
| 1.2 STEAP4功能研究 | 第20-24页 |
| 1.2.1 炎症因子调控STEAP4表达 | 第20-21页 |
| 1.2.2 STEAP4在脂肪细胞分化过程中表达 | 第21-22页 |
| 1.2.3 STEAP4与胰岛素敏感性相关因子关系 | 第22页 |
| 1.2.4 STEAP4整合炎症和代谢应答 | 第22-23页 |
| 1.2.5 STEAP4参与细胞凋亡及增殖 | 第23页 |
| 1.2.6 其他因子调控STEAP4的表达 | 第23-24页 |
| 1.3 STEAP4与疾病的发生 | 第24-26页 |
| 1.3.1 STEAP4与前列腺癌的发生 | 第24页 |
| 1.3.2 STEAP4与人的肥胖及胰岛素抵抗 | 第24-25页 |
| 1.3.3 STEAP4与颈动脉粥样硬化 | 第25页 |
| 1.3.4 STEAP4与关节炎及风湿性关节炎 | 第25-26页 |
| 1.4 C/EBPβ相关介绍 | 第26页 |
| 1.5 研究的目的和意义 | 第26-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-46页 |
| 2.1 材料 | 第27-30页 |
| 2.1.1 RNA与cDNA样品 | 第27页 |
| 2.1.2 DNA样品 | 第27页 |
| 2.1.3 培养基、工具酶及试剂盒 | 第27-28页 |
| 2.1.4 常用溶液配方 | 第28页 |
| 2.1.5 菌株与细胞 | 第28-29页 |
| 2.1.6 主要实验仪器 | 第29页 |
| 2.1.7 分子生物学相关软件 | 第29-30页 |
| 2.2 方法 | 第30-46页 |
| 2.2.1 STEAP4基因的克隆 | 第30-35页 |
| 2.2.1.1 组织总RNA的提取 | 第30页 |
| 2.2.1.2 组织总RNA的纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.1.3 总RNA质量和纯度检测 | 第31页 |
| 2.2.1.4 扩增STEAP4基因cDNA片段的引物设计 | 第31-32页 |
| 2.2.1.5 总cDNA模板的获取 | 第32-33页 |
| 2.2.1.6 PCR反应扩增目的片段 | 第33页 |
| 2.2.1.7 PCR扩增产物的回收与纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.1.8 扩增产物的鉴定(克隆和测序) | 第34-35页 |
| 2.2.2 STEAP基因组序列的分析 | 第35页 |
| 2.2.3 染色体电子定位分析 | 第35-36页 |
| 2.2.4 半定量RT-PCR进行猪STEAP4基因组织表达谱分析 | 第36-37页 |
| 2.2.4.1 组织表达谱的引物设计 | 第36页 |
| 2.2.4.2 STEAP4基因和GAPDH基因扩增的指数期循环数确定 | 第36页 |
| 2.2.4.3 半定量RT-PCR扩增的反应条件 | 第36-37页 |
| 2.2.4.4 半定量结果分析 | 第37页 |
| 2.2.5 检测细胞中ATP的含量 | 第37-41页 |
| 2.2.5.1 真核表达载体构建 | 第37-38页 |
| 2.2.5.2 大量提取质粒 | 第38-39页 |
| 2.2.5.3 质粒浓度和纯度的检测 | 第39页 |
| 2.2.5.4 细胞培养 | 第39页 |
| 2.2.5.5 细胞转染 | 第39页 |
| 2.2.5.6 细胞中ATP检测方法 | 第39-40页 |
| 2.2.5.7 细胞中蛋白质总量测定 | 第40-41页 |
| 2.2.5.8 数值处理 | 第41页 |
| 2.2.6 定量RT-PCR检测STEAP4超表达后细胞中TNFα含量变化 | 第41-43页 |
| 2.2.6.1 细胞mRNA的提取、纯化、检测和反转录 | 第41页 |
| 2.2.6.2 定量检测引物设计 | 第41-42页 |
| 2.2.6.3 Real-Time PCR扩增条件 | 第42-43页 |
| 2.2.6.4 数据统计分析 | 第43页 |
| 2.2.7 STEAP4基因启动子扩增 | 第43-44页 |
| 2.2.7.1 基因组DNA的提取 | 第43页 |
| 2.2.7.2 猪和小鼠STEAP4基因启动子扩增引物设计 | 第43-44页 |
| 2.2.7.3 猪和小鼠STEAP4基因启动子的扩增 | 第44页 |
| 2.2.8 启动子活性检测 | 第44-46页 |
| 2.2.8.1 荧光素酶载体的构建 | 第45页 |
| 2.2.8.2 双荧光素酶报告系统检测启动子活性 | 第45-46页 |
| 2.2.8.3 试验数据统计分析 | 第46页 |
| 2.2.9 LPS和resistin刺激对STEAP4表达的影响 | 第46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-65页 |
| 3.1 猪STEAP4基因全长cDNA的克隆与序列分析 | 第46-52页 |
| 3.1.1 猪STEAP4基因全编码区cDNA和变体的克隆 | 第46-47页 |
| 3.1.2 猪STEAP4序列分析 | 第47-50页 |
| 3.1.3 猪STEAP4基因组结构分析 | 第50-52页 |
| 3.2 猪STEAP4染色体定位 | 第52页 |
| 3.3 猪STEAP4及其变体的组织表达谱 | 第52-54页 |
| 3.4 猪STEAP4对HepG2细胞中ATP含量的影响 | 第54-55页 |
| 3.5 STEAP4及其变体超表达对RAW264.7巨噬细胞中TNFα表达量的影响 | 第55-56页 |
| 3.6 猪STEAP4基因启动子区的克隆及顺式作用元件预测分析 | 第56-57页 |
| 3.7 猪STEAP4启动子区活性检测 | 第57-58页 |
| 3.8 脂肪细胞分化相关转录因子对STEAP4启动子的调控作用 | 第58-59页 |
| 3.9 C/EBPα、C/EBPβ对STEAP4表达量的影响 | 第59-61页 |
| 3.9.1 C/EBPα、C/EBPβ对STEAP4 mRNA表达量的影响 | 第59-60页 |
| 3.9.2 C/EBPα、C/EBPβ对猪和小鼠STEAP4启动子调控对比 | 第60-61页 |
| 3.10 C/EBPβ对不同区段STEAP4启动子活性的影响 | 第61-62页 |
| 3.11 C/EBPβ对STEAP4启动子结合位点的依赖性 | 第62-63页 |
| 3.12 脂多糖(LPS)对猪MSC细胞中STEAP4基因表达的影响 | 第63页 |
| 3.13 Resistin对HepG2细胞中STEAP4表达的调控 | 第63-65页 |
| 4 讨论 | 第65-69页 |
| 4.1 猪STEAP4基因的结构分析 | 第65页 |
| 4.2 猪STEAP4基因的染色体定位 | 第65页 |
| 4.3 猪STEAP4基因表达的组织差异 | 第65-66页 |
| 4.4 猪STEAP4基因变体 | 第66页 |
| 4.5 猪STEAP4对细胞中ATP含量的影响 | 第66-67页 |
| 4.6 猪STEAP4影响巨噬细胞中TNFα的表达 | 第67页 |
| 4.7 猪STEAP4基因启动子活性分析 | 第67页 |
| 4.8 猪STEAP4基因受到C/EBPβ的调节作用 | 第67-68页 |
| 4.9 C/EBPβ在猪STEAP4启动子上具体的结合位点探讨 | 第68页 |
| 4.10 猪STEAP4对脂多糖(LPS)的应答反应 | 第68-69页 |
| 4.11 人STEAP4对resistin的应答反应 | 第69页 |
| 5 结论与创新点 | 第69-71页 |
| 5.1 结论 | 第69-70页 |
| 5.2 创新点 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 研究生在读期间论文发表情况 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
