| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词索引表 | 第8-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-39页 |
| 前言 | 第16页 |
| 1 奶牛乳腺炎的研究进展 | 第16-21页 |
| 1.1 奶牛乳腺炎的致病因素 | 第16页 |
| 1.2 奶牛乳腺炎的类型及特征 | 第16-17页 |
| 1.3 奶牛乳腺炎的诊断 | 第17-18页 |
| 1.3.1 临床诊断 | 第17页 |
| 1.3.2 实验室诊断 | 第17-18页 |
| 1.4 奶牛乳腺炎对奶牛业的影响 | 第18-19页 |
| 1.5 奶牛乳腺的防御反应 | 第19页 |
| 1.6 奶牛乳腺炎的治疗 | 第19-20页 |
| 1.6.1 抗生素及中草药 | 第19-20页 |
| 1.6.2 抗性基因 | 第20页 |
| 1.7 链球菌型乳腺炎研究进展 | 第20-21页 |
| 1.7.1 链球菌简介 | 第20-21页 |
| 1.7.2 链球菌型乳腺炎 | 第21页 |
| 1.7.3 链球菌型乳腺炎动物模型 | 第21页 |
| 2 miRNA的研究进展 | 第21-26页 |
| 2.1 miRNA的生物学合成 | 第21-22页 |
| 2.2 miRNA的作用机制 | 第22-23页 |
| 2.3 miRNA的鉴定 | 第23页 |
| 2.4 miRNA的功能研究 | 第23-25页 |
| 2.4.1 miRNA靶基因的预测 | 第23-24页 |
| 2.4.2 miRNA靶基因的验证 | 第24-25页 |
| 2.5 miRNA与乳腺炎 | 第25页 |
| 2.6 miR-122 | 第25-26页 |
| 3 JAK-STAT信号通路 | 第26-29页 |
| 3.1 JAK-STAT通路简介 | 第26-27页 |
| 3.2 JAK-STAT通路与免疫调节 | 第27页 |
| 3.3 miRNA与JAK-STAT通路 | 第27-28页 |
| 3.4 EPO与JAK-STAT通路 | 第28-29页 |
| 4 原代乳腺上皮细胞培养研究进展 | 第29页 |
| 4.1 原代乳腺上皮细胞培养概述 | 第29页 |
| 4.2 原代乳腺上皮细胞培养方法比较 | 第29页 |
| 5 本研究的目的与意义 | 第29-30页 |
| 参考文献 | 第30-39页 |
| 第二章 奶牛链球菌型乳腺炎乳腺组织基因表达分析 | 第39-55页 |
| 1 材料与方法 | 第39-42页 |
| 1.1 试验动物 | 第39页 |
| 1.2 菌种复苏 | 第39页 |
| 1.3 主要试剂与仪器设备 | 第39-40页 |
| 1.4 奶牛链球菌型乳腺炎模型的建立 | 第40页 |
| 1.5 组织样品的采集 | 第40页 |
| 1.6 样品芯片分析前处理 | 第40-42页 |
| 1.6.1 总RNA的提取 | 第40-41页 |
| 1.6.2 总RNA的纯化 | 第41页 |
| 1.6.3 cDNA第一链和第二链一步法合成 | 第41页 |
| 1.6.4 荧光标记cRNA合成与纯化 | 第41-42页 |
| 1.6.5 cRNA样品片段化和芯片杂交、洗涤及扫描 | 第42页 |
| 1.6.6 表达谱芯片数据分析 | 第42页 |
| 2 结果 | 第42-51页 |
| 2.1 奶牛链球菌型乳腺炎模型建立 | 第42-43页 |
| 2.2 样品总RNA质控 | 第43页 |
| 2.3 基因芯片杂交扫描 | 第43-44页 |
| 2.4 基因芯片数据处理 | 第44-45页 |
| 2.5 差异表达基因 | 第45-49页 |
| 2.6 差异表达基因KEGG分析 | 第49-51页 |
| 3 讨论 | 第51-52页 |
| 3.1 奶牛链球菌型乳腺炎模型的建立 | 第51-52页 |
| 3.2 基因芯片差异表达基因与奶牛乳腺炎的相关研究 | 第52页 |
| 4 小结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-55页 |
| 第三章 奶牛链球菌型乳腺炎乳腺组织microRNA表达分析 | 第55-75页 |
| 1 材料和方法 | 第55-60页 |
| 1.1 试验动物及链球菌型乳腺炎诱导 | 第55页 |
| 1.2 样品采集及总RNA的提取与纯化 | 第55页 |
| 1.3 Solexa测序构建小RNA文库 | 第55-56页 |
| 1.4 测序结果生物信息学分析 | 第56-59页 |
| 1.4.1 小RNA长度分布 | 第57页 |
| 1.4.2 样品间小RNA公共及特有序列分析 | 第57页 |
| 1.4.3 小RNA序列比对注释 | 第57页 |
| 1.4.4 已知miRNA鉴定与新的miRNA预测 | 第57-58页 |
| 1.4.5 miRNA差异分析 | 第58页 |
| 1.4.6 miRNA靶基因预测分析 | 第58页 |
| 1.4.7 GO富集分析 | 第58-59页 |
| 1.4.8 KEGG通路分析 | 第59页 |
| 1.5 部分差异表达miRNA荧光定量验证 | 第59-60页 |
| 1.5.1 miRNA反转录为cDNA | 第59-60页 |
| 1.5.2 荧光定量反应 | 第60页 |
| 2 结果 | 第60-70页 |
| 2.1 数据处理及长度分布 | 第60-62页 |
| 2.2 样品间小RNA公共及特有序列分析 | 第62-63页 |
| 2.3 小RNA序列比对注释 | 第63-65页 |
| 2.4 候选miRNA的预测 | 第65页 |
| 2.5 miRNA的差异分析 | 第65-68页 |
| 2.6 miRNA荧光定量验证 | 第68页 |
| 2.7 对已知差异miRNA的靶基因预测及GO分析和KEGG分析 | 第68-70页 |
| 3 讨论 | 第70-71页 |
| 4 小结 | 第71页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 第四章 Bta-miR-122靶向EPO的双荧光素酶验证 | 第75-87页 |
| 1 材料与方法 | 第75-81页 |
| 1.1 主要仪器、试剂和材料 | 第75-76页 |
| 1.2 牛EPO基因野生型重组载体构建 | 第76-79页 |
| 1.2.1 奶牛乳腺组织RNA的提取 | 第76页 |
| 1.2.2 EPO基因3'UTR片段的PCR扩增及纯化 | 第76-78页 |
| 1.2.3 PCR产物的双酶切及回收纯化与连接 | 第78页 |
| 1.2.4 转化 | 第78页 |
| 1.2.5 菌落PCR鉴定 | 第78-79页 |
| 1.2.6 PCR产物测序 | 第79页 |
| 1.3 牛EPO基因突变型载体构建 | 第79-80页 |
| 1.3.1 突变分段PCR | 第79页 |
| 1.3.2 突变两段拼接 | 第79-80页 |
| 1.3.3 拼接后PCR双酶切、回收纯化及连接 | 第80页 |
| 1.3.4 菌落扩大培养提取质粒 | 第80页 |
| 1.4 293T细胞转染 | 第80-81页 |
| 1.5 数据处理和分析 | 第81页 |
| 2 结果与分析 | 第81-84页 |
| 2.1 EPO基因3'UTR PCR扩增 | 第81-82页 |
| 2.2 菌落PCR产物电泳结果 | 第82页 |
| 2.3 阳性克隆测序结果 | 第82-83页 |
| 2.4 野生型载体突变 | 第83页 |
| 2.5 miR-122与EPO 3'UTR靶位点双荧光素酶报告基因的检测结果 | 第83-84页 |
| 3 讨论 | 第84-85页 |
| 3.1 miRNA靶基因的预测与鉴定 | 第84-85页 |
| 3.2 miR-122靶向调控EPO基因 | 第85页 |
| 4 小结 | 第85页 |
| 参考文献 | 第85-87页 |
| 第五章 奶牛原代乳腺上皮细胞培养方法的建立及细胞转染条件的优化 | 第87-100页 |
| 1 材料与方法 | 第87-91页 |
| 1.1 主要仪器设备与试剂 | 第87-88页 |
| 1.2 奶牛乳腺上皮细胞原代培养 | 第88页 |
| 1.3 乳腺上皮细胞的纯化与传代 | 第88页 |
| 1.4 乳腺上皮细胞形态观察 | 第88页 |
| 1.5 乳腺上皮细胞的生长计数 | 第88-89页 |
| 1.6 乳腺上皮细胞的冻存与复苏 | 第89页 |
| 1.7 乳腺上皮细胞β酪蛋白基因(CSN2)表达检测 | 第89-91页 |
| 1.8 转染条件的优化 | 第91页 |
| 2 结果 | 第91-95页 |
| 2.1 乳腺上皮细胞原代培养 | 第91-93页 |
| 2.2 乳腺上皮细胞形态观察 | 第93页 |
| 2.3 乳腺上皮细胞生长曲线 | 第93-94页 |
| 2.4 β酪蛋白基因(CSN2)荧光定量产物电泳结果 | 第94页 |
| 2.5 不同转染浓度和转染试剂量组合的转染效果比较 | 第94-95页 |
| 3 讨论 | 第95-97页 |
| 3.1 乳腺上皮细胞体外培养 | 第95-97页 |
| 3.2 细胞转染影响因素 | 第97页 |
| 4 小结 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-100页 |
| 第六章 miR-122过表达和抑制表达对EPO及JAK-STAT通路部分基因的表达影响 | 第100-109页 |
| 1 材料与方法 | 第100-102页 |
| 1.1 仪器与试剂 | 第100页 |
| 1.2 miR-122 mimic和miR-122 inhibitor转染细胞 | 第100-101页 |
| 1.3 乳腺上皮细胞转染miR-122mimic后miR-122的表达检测 | 第101-102页 |
| 1.3.1 细胞miRNA的反转录 | 第101页 |
| 1.3.2 miR-122的表达实时荧光定量反应 | 第101-102页 |
| 1.4 EPO、EPOR、JAK2、STAT5A、STAT5B、Bcl-2基因的实时荧光定量反应 | 第102页 |
| 1.5 数据处理和分析 | 第102页 |
| 2 结果与分析 | 第102-104页 |
| 2.1 乳腺上皮细胞转染mimic后miR-122的表达变化 | 第102-103页 |
| 2.2 miR-122过表达对EPO及JAK-STAT通路基因EPOR、JAK2、STAT5A、STAT5B、Bcl-2表达的影响 | 第103-104页 |
| 2.3 miR-122抑制表达对EPO及JAK-STAT通路基因EPOR、JAK2、STAT5A、STAT5B、Bcl-2表达的影响 | 第104页 |
| 3 讨论 | 第104-106页 |
| 3.1 JAK-STAT通路与乳腺的关系 | 第104页 |
| 3.2 JAK-STAT通路基因与免疫的关系 | 第104-105页 |
| 3.3 miRNA与JAK-STAT通路的调控关系 | 第105页 |
| 3.4 miR-122靶向调控JAK-STAT通路的意义 | 第105-106页 |
| 4 小结 | 第106页 |
| 参考文献 | 第106-109页 |
| 第七章 全文结论及创新点 | 第109-110页 |
| 1 结论 | 第109页 |
| 2 创新点 | 第109-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
| 博士期间发表论文 | 第111-112页 |
