| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩写符号术语表 | 第12-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-43页 |
| 1.1 腈化合物和腈转化酶 | 第17-19页 |
| 1.2 腈水合酶 | 第19-35页 |
| 1.2.1 腈水合酶的来源 | 第19-23页 |
| 1.2.2 腈水合酶的种类 | 第23-24页 |
| 1.2.3 腈水合酶的生物合成调节 | 第24-26页 |
| 1.2.4 腈水合酶的结构特征 | 第26-28页 |
| 1.2.5 腈水合酶的反应机理 | 第28-29页 |
| 1.2.6 腈水合酶的性质 | 第29-33页 |
| 1.2.7 腈水合酶的应用 | 第33-35页 |
| 1.3 腈水合酶基因重组表达的研究现状 | 第35-36页 |
| 1.4 腈水合酶基因的探矿 | 第36-38页 |
| 1.5 烟酰胺 | 第38-40页 |
| 1.5.1 烟酰胺生产情况 | 第39页 |
| 1.5.2 烟酰胺的生产方法 | 第39-40页 |
| 1.6 本课题的研究意义 | 第40-41页 |
| 1.7 本课题的研究思路和内容 | 第41-43页 |
| 第二章 腈水合酶基因的数据挖掘与分析 | 第43-58页 |
| 2.1 引言 | 第43页 |
| 2.2 材料与方法 | 第43-46页 |
| 2.2.1 蛋白质序列比对和分子探针的选择 | 第44页 |
| 2.2.2 数据库中同源序列的搜索和汇集 | 第44页 |
| 2.2.3 序列分析和目标基因的选择 | 第44-45页 |
| 2.2.4 针对目标基因的引物设计 | 第45页 |
| 2.2.5 基因克隆、表达和定性 | 第45-46页 |
| 2.3 实验结果 | 第46-57页 |
| 2.3.1 腈水合酶多序列比对 | 第46-50页 |
| 2.3.2 腈水合酶的保守片段分析 | 第50页 |
| 2.3.3 腈水合酶基因资源的数据挖掘 | 第50-54页 |
| 2.3.4 腈水合酶序列分析和目标选定 | 第54-57页 |
| 2.4 小结 | 第57-58页 |
| 第三章 铁型腈水合酶的重组表达体系及性质研究 | 第58-91页 |
| 3.1 引言 | 第58页 |
| 3.2 材料与方法 | 第58-70页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第58页 |
| 3.2.2 实验试剂 | 第58-59页 |
| 3.2.3 菌种和质粒 | 第59页 |
| 3.2.4 培养基和培养条件 | 第59页 |
| 3.2.5 腈水合酶基因的克隆和重组质粒的构建 | 第59-62页 |
| 3.2.6 E.coli BL21(DE3)和E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第62页 |
| 3.2.7 重组质粒的转化和验证 | 第62-63页 |
| 3.2.8 重组腈水合酶的诱导和表达 | 第63页 |
| 3.2.9 重组腈水合酶的纯化 | 第63-64页 |
| 3.2.10 Ni-NTA层析柱的再生 | 第64页 |
| 3.2.11 腈水合酶活力的测定方法 | 第64-66页 |
| 3.2.12 重组腈水合酶NHase_F1的酶学性质表征 | 第66-67页 |
| 3.2.13 重组NHase_F1的底物特异性 | 第67页 |
| 3.2.14 不同化合物对NHase_F1活力的影响 | 第67-68页 |
| 3.2.15 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第68-69页 |
| 3.2.16 蛋白质浓度的测定 | 第69-70页 |
| 3.2.17 重组腈水合酶转化3-氰基吡啶实验 | 第70页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第70-90页 |
| 3.3.1 P.putida F1腈水合酶基因簇结构分析 | 第70-73页 |
| 3.3.2 Pseudomonas putida F1基因组DNA的提取 | 第73-74页 |
| 3.3.3 腈水合酶基因片段的扩增 | 第74页 |
| 3.3.4 重组腈水合酶质粒构建和转化 | 第74-77页 |
| 3.3.5 重组腈水合酶NHase_F1的表达 | 第77-79页 |
| 3.3.6 重组腈水合酶F1的纯化 | 第79-81页 |
| 3.3.7 腈水合酶NHase_F1的酶学性质表征 | 第81-89页 |
| 3.3.8 重组NHase_F1催化生产烟酰胺的初步实验 | 第89-90页 |
| 3.4 小结 | 第90-91页 |
| 第四章 钴型腈水合酶的重组表达体系及性质研究 | 第91-113页 |
| 4.1 引言 | 第91页 |
| 4.2 材料与方法 | 第91-97页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第91-92页 |
| 4.2.2 实验试剂 | 第92页 |
| 4.2.3 菌种和质粒 | 第92页 |
| 4.2.4 培养基和培养条件 | 第92页 |
| 4.2.5 腈水合酶基因的克隆和质粒构建 | 第92-95页 |
| 4.2.6 表达载体的选择 | 第95页 |
| 4.2.7 重组NHas_ 08的诱导表达和纯化 | 第95页 |
| 4.2.8 腈水合酶活力的测定方法 | 第95-96页 |
| 4.2.9 重组NHase_08的酶学性质表征 | 第96页 |
| 4.2.10 重组NHase_08的底物特异性 | 第96页 |
| 4.2.11 不同化合物对NHase_08活力的影响 | 第96-97页 |
| 4.2.12 蛋白质检测 | 第97页 |
| 4.3 实验结果 | 第97-111页 |
| 4.3.1 不同来源的重组钴型腈水合酶的比较 | 第97-98页 |
| 4.3.2 A.manganoxydans基因组关于腈水合酶的信息分析 | 第98-99页 |
| 4.3.3 A.manganoxydans基因组DNA的抽提 | 第99-100页 |
| 4.3.4 腈水合酶基因的克隆 | 第100-101页 |
| 4.3.5 A.manganoxydans腈水合酶基因簇的分析 | 第101页 |
| 4.3.6 重组NHase_08表达质粒的构建 | 第101-103页 |
| 4.3.7 重组NHase-08的诱导和表达 | 第103页 |
| 4.3.8 其它重组NHase_08表达质粒的构建和表达 | 第103-105页 |
| 4.3.9 重组NHase_08的纯化 | 第105-106页 |
| 4.3.10 重组NHase_08的酶学性质表征 | 第106-111页 |
| 4.4 小结 | 第111-113页 |
| 第五章 重组NHase_08基因工程菌发酵工程的研究 | 第113-133页 |
| 5.1 引言 | 第113-114页 |
| 5.2 材料与方法 | 第114-117页 |
| 5.2.1 实验仪器 | 第114页 |
| 5.2.2 实验材料 | 第114页 |
| 5.2.3 培养基 | 第114-115页 |
| 5.2.4 培养方法 | 第115-116页 |
| 5.2.5 有机氮源的筛选和优化 | 第116页 |
| 5.2.6 分析方法 | 第116-117页 |
| 5.2.7 碳源的组成优化的实验设计 | 第117页 |
| 5.2.8 SAS软件 | 第117页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第117-131页 |
| 5.3.1 氮源的筛选 | 第117-118页 |
| 5.3.2 酵母抽提物浓度 | 第118-119页 |
| 5.3.3 无机盐 | 第119页 |
| 5.3.4 氯化钴浓度 | 第119-121页 |
| 5.3.5 自动诱导培养基的优化 | 第121-124页 |
| 5.3.6 自动诱导培养基AIM和LB培养基的比较 | 第124-125页 |
| 5.3.7 腈水合酶的发酵试验 | 第125-131页 |
| 5.4 小结 | 第131-133页 |
| 第六章 重组NHase_08催化生产烟酰胺的初步研究 | 第133-140页 |
| 6.1 引言 | 第133页 |
| 6.2 材料与方法 | 第133-135页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第133页 |
| 6.2.2 培养基 | 第133-134页 |
| 6.2.3 培养方法 | 第134页 |
| 6.2.4 3-氰基吡啶浓度对催化反应的影响 | 第134页 |
| 6.2.5 分批补料催化反应模型 | 第134页 |
| 6.2.6 烟酰胺的分离和纯化 | 第134-135页 |
| 6.2.7 分析方法 | 第135页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第135-139页 |
| 6.3.1 底物浓度对反应速度的影响 | 第135-136页 |
| 6.3.2 分批补料催化工艺的而研究 | 第136-137页 |
| 6.3.3 微生物法生产烟酰胺的比较 | 第137-138页 |
| 6.3.4 产品烟酰胺的纯化 | 第138-139页 |
| 6.3.5 烟酰胺的鉴定 | 第139页 |
| 6.4 小结 | 第139-140页 |
| 第七章 结论与展望 | 第140-144页 |
| 7.1 结论 | 第140-142页 |
| 7.2 本论文的创新点 | 第142-143页 |
| 7.3 建议 | 第143-144页 |
| 附录 | 第144-156页 |
| 个人简历 | 第156-157页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第157-158页 |
| 参考文献 | 第158-176页 |
