| 中文摘要 | 第8-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 前言 | 第14-23页 |
| 一、载脂蛋白基因簇 | 第14-16页 |
| 二、载脂蛋白ApoAI／CIII／AIV／AV基因簇的结构与功能 | 第16-18页 |
| 三、ApoAI／CIII／AIV／AV基因簇基因功能的转基因动物研究 | 第18-19页 |
| 四、ApoAI／CIII／AIV／AV基因簇的基因表达调控研究 | 第19-22页 |
| 五、本研究的主要内容 | 第22-23页 |
| 材料与方法 | 第23-47页 |
| 一、材料 | 第23-25页 |
| 1.BAC克隆 | 第23页 |
| 2.菌株与质粒 | 第23-24页 |
| 3.实验用小鼠及高脂饲料 | 第24页 |
| 4.限制性内切酶及修饰酶 | 第24页 |
| 5.其它主要试剂 | 第24页 |
| 6.放射性核素 | 第24页 |
| 7.主要仪器设备 | 第24-25页 |
| 二、实验方法 | 第25-47页 |
| 1.BAC介导的人载脂蛋白apoAI基因簇突变株转基因小鼠的基本技术路线 | 第25-27页 |
| 2.利用同源重组从BAC DNA中删除apoCIII增强子核心序列 | 第27-32页 |
| 2.1.利用同源重组在E.coli中对BAC进行修饰的技术路线 | 第27页 |
| 2.2.质粒DNA的小量制备 | 第27-28页 |
| 2.3.质粒DNA的大量制备 | 第28-29页 |
| 2.4.用于重组的穿梭载体的构建 | 第29-30页 |
| 2.4.1.突变盒序列的PCR扩增和PCR产物回收 | 第29页 |
| 2.4.2.连接反应 | 第29-30页 |
| 2.4.3.感受态细胞制备 | 第30页 |
| 2.4.4.感受态细胞的转化 | 第30页 |
| 2.4.5.克隆筛选 | 第30页 |
| 2.5.含有BAC DNA的感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.6.感受态细胞的转化及重组体的正-筛选 | 第30页 |
| 2.7.镰孢菌酸(FA)反筛选确定突变BAC克隆 | 第30-31页 |
| 2.8.Southern杂交鉴定BAC突变体 | 第31-32页 |
| 3.显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第32页 |
| 4.受精卵培养基的配制与保存 | 第32-33页 |
| 4.1.贮存液的成分及配制 | 第32页 |
| 4.2.M2和M16工作液的配制 | 第32-33页 |
| 5.小鼠的选择与处理 | 第33页 |
| 6.超排卵和取卵 | 第33-34页 |
| 7.显微注射 | 第34-37页 |
| 7.1.持卵针的制备 | 第34页 |
| 7.2.显微注射针的拉制 | 第34页 |
| 7.3.显微注射槽的制备 | 第34页 |
| 7.4.显微注射 | 第34-37页 |
| 8.输卵管移卵 | 第37-39页 |
| 8.1.移卵针的制备 | 第37页 |
| 8.2.受精卵在移卵针中的排列 | 第37-38页 |
| 8.3.输卵管移卵 | 第38-39页 |
| 9.鼠尾基因组DNA的提取 | 第39-40页 |
| 10.利用PCR和Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第40页 |
| 10.1.PCR法鉴定转基因鼠 | 第40页 |
| 10.2.Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第40页 |
| 11.小鼠器官组织的采集和保存 | 第40页 |
| 12.转基因小鼠传代 | 第40-41页 |
| 13.组织RNA提取 | 第41页 |
| 14.RNase保护实验检测转基因小鼠中人载脂蛋白转基因的表达 | 第41-44页 |
| 14.1.RNase保护实验探针质粒的构建 | 第41-42页 |
| 14.2.RNA探针的标记 | 第42页 |
| 14.3.RNA探针的纯化 | 第42-43页 |
| 14.4.RNA:RNA杂交 | 第43页 |
| 14.5.RNase反应、变性胶电泳及放射自显影 | 第43-44页 |
| 15.小鼠血脂水平的测定 | 第44页 |
| 16.小鼠冠脉血管动脉粥样硬化斑块形成的检测 | 第44-46页 |
| 16.1.载脂蛋白apoE基因敲除小鼠的RT-PCR鉴定 | 第44页 |
| 16.1.1.提取正常鼠与apoE敲除鼠的肝脏总RNA | 第44页 |
| 16.1.2.反转录成cDNA第一链 | 第44页 |
| 16.1.3.RT-PCR | 第44页 |
| 16.2.实验小鼠的分组与高脂饲料喂养 | 第44-45页 |
| 16.2.1.实验小鼠的分组 | 第44-45页 |
| 16.2.2.高脂饲料成分与喂养 | 第45页 |
| 16.3.小鼠冠脉血管脂质沉淀与动脉粥样硬化斑块的检测 | 第45-46页 |
| 16.3.1.组织样本的分离与处理 | 第45页 |
| 16.3.2.冰冻切片 | 第45-46页 |
| 16.3.3.切片的固定与染色 | 第46页 |
| 17.高脂饲料对转基因小鼠ApoAI基因簇基因表达水平调节的检测 | 第46-47页 |
| 实验结果 | 第47-63页 |
| 一、利用同源重组从含完整人apoAI／CIII／AIV／AV基因簇的BAC286I4 DNA中定位删除apo CIII增强子核心序列 | 第47-50页 |
| 1.用于重组的穿梭载体pSV-RecA-ΔCIII enhancer的构建 | 第47页 |
| 2.穿梭载体在含BAC286I4大肠杆菌细胞中的同源重组和重组体的正负筛选 | 第47页 |
| 3.利用Southern杂交和序列测定鉴定BAC286I4的突变体 | 第47-50页 |
| 二、显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第50-51页 |
| 三、ApoAI／CIII／AIV／AV基因簇突变转基因小鼠株系的建立 | 第51-52页 |
| 四、比较正常与突变ApoAI基因簇转基因小鼠中各apo基因的表达 | 第52-58页 |
| 1.正常转基因小鼠中各apo基因的表达 | 第52-54页 |
| 2.突变转基因小鼠中各apo基因的表达 | 第54-58页 |
| 五、正常ApoAI／CIII／AIV／AV基因簇转基因小鼠模型的研究 | 第58-63页 |
| 1.转基因小鼠血脂水平 | 第58页 |
| 2.高脂饲料诱导后对照组与转基因组小鼠冠脉血管切片 | 第58-60页 |
| 2.1.载脂蛋白apoE基因敲除小鼠的鉴定 | 第58-60页 |
| 2.2.小鼠冠脉血管切片 | 第60页 |
| 3.高脂饲料对转基因小鼠中人apo基因表达的影响 | 第60-63页 |
| 讨论 | 第63-77页 |
| 一、包含人类基因组DNA片段的BAC克隆用于转基因动物研究 | 第63-64页 |
| 二、人ApoAI／CIII／AIV／AV基因簇的表达调控与apoCIII增强子的作用 | 第64-69页 |
| 1.人apo基因在ApoAI簇转基因小鼠体内显示正常的组织特异性表达 | 第64-66页 |
| 2.ApoAI簇基因在正常转基因鼠内呈现整合位点非依赖性和近似拷贝数依赖性的表达模式 | 第66-67页 |
| 3.apoCIII增强子整体内调控apoAI、CIII、AIV的肝肠组织特异性表达 | 第67-68页 |
| 4.apoCIII增强子不调控远端apoAV基因的表达 | 第68-69页 |
| 5.ApoCIII增强子与LCR的比较 | 第69页 |
| 三、ApoAI／CIII／AIV／AV基因簇与脂类代谢及相关疾病 | 第69-74页 |
| 1.ApoCIII对甘油三酯代谢的抑制作用似强于apoAV的促进作用 | 第69-70页 |
| 2.ApoAI基因簇对胆固醇代谢的综合调节作用 | 第70-71页 |
| 3.高脂饲料诱发ApoAI簇转基因小鼠HDL胆固醇含量显著升高 | 第71-72页 |
| 4.小鼠遗传背景与动脉粥样硬化易感性 | 第72-73页 |
| 5.高脂饮食对于肝肠apo基因表达的不同调控 | 第73-74页 |
| 四、本研究的不足与改进 | 第74页 |
| 五、载脂蛋白、脂类代谢以及动脉粥样硬化的研究方法展望 | 第74-77页 |
| 小结 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-88页 |
| 文献综述 | 第88-104页 |
| 英文名词及缩写 | 第104-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 个人简历 | 第107页 |
