| 第一章 本论文立论依据 | 第18-25页 |
| 第二章 含硒谷胱甘肽转硫酶在Eschericoli coli中的表达研究 | 第25-71页 |
| 第一节 前言 | 第25-27页 |
| 第二节 含硒谷胱甘肽转硫酶的设计和构建 | 第27-46页 |
| 一、实验材料 | 第27-29页 |
| 二、实验方法 | 第29-37页 |
| 2.1 质粒的提取 | 第29页 |
| 2.2 gst基因突变体的构建 | 第29-34页 |
| 2.2.1 GST-S突变体的构建 | 第29-31页 |
| 2.2.2 GST-U突变体的构建 | 第31-33页 |
| 2.2.3 GST-Sec突变体的构建 | 第33页 |
| 2.2.4 sjGST，GST-S，GST-U和GST-Sec融合表达系统的构建 | 第33-34页 |
| 2.3 DNA片段的酶切与连接 | 第34-36页 |
| 2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| 2.5 连接产物的转化 | 第37页 |
| 2.6 阳性克隆的筛选及其鉴定 | 第37页 |
| 2.7 重组质粒及其菌种的保存 | 第37页 |
| 三、结果分析 | 第37-43页 |
| 3.1 含硒GST突变体的设计 | 第37-39页 |
| 3.2 GST突变体的构建 | 第39-42页 |
| 3.2.1 gst-s基因突变体的构建 | 第39-40页 |
| 3.2.2 gst-u基因突变体的构建 | 第40-41页 |
| 3.2.3 gst-Sec基因突变体的构建 | 第41-42页 |
| 3.3 GST融合表达系统的构建 | 第42-43页 |
| 3.3.1 利用载体pGEX-2T构建sjGST，GST-S，GST-U和GST-Sec融合表达系统 | 第42-43页 |
| 3.3.2 PelB／GST融合表述系统的构建 | 第43页 |
| 四、讨论 | 第43-46页 |
| 第三节 含硒谷胱甘肽转硫酶在Eschericoli coli中的表达 | 第46-58页 |
| 一、实验材料 | 第46-47页 |
| 二、实验方法 | 第47-50页 |
| 2.1 转化 | 第47-48页 |
| 2.1.1 单载体转化 | 第47页 |
| 2.1.2 双载体转化 | 第47-48页 |
| 2.2 目的基因的诱导表达 | 第48页 |
| 2.2.1 sjGST，GST-S，sjGST／sjGST目的基因的诱导表达 | 第48页 |
| 2.2.2 GST-U，GST-Sec，sjGST／GST-Sec和PelB／GST-Sec目的基因的诱导表达 | 第48页 |
| 2.3 表达产物的鉴定 | 第48-50页 |
| 2.3.1 蛋白质印迹 | 第48-49页 |
| 2.3.2 ~(75)Se放射性自显影 | 第49-50页 |
| 三、结果分析 | 第50-55页 |
| 3.1 sjGST，GST-S，GST-U，GST-Sec目的基因的诱导表达 | 第50-52页 |
| 3.2 sjGST／sjGST和sjGST／GST-Sec目的基因的诱导表达 | 第52-54页 |
| 3.3 PelB／GST-Sec目的基因的诱导表达 | 第54-55页 |
| 四、讨论 | 第55-58页 |
| 第四节 含硒谷胱甘肽转硫酶的分离纯化和性质分析 | 第58-67页 |
| 一、实验材料 | 第58-59页 |
| 二、实验方法 | 第59-61页 |
| 2.1 谷胱甘肽转硫酶的分离纯化 | 第59页 |
| 2.1.1 亲和层析 | 第59页 |
| 2.1.2 HPLC分离纯化 | 第59页 |
| 2.2 蛋白质含量的测定 | 第59-60页 |
| 2.3 蛋白质的圆二色谱分析 | 第60页 |
| 2.4 蛋白质的荧光分析 | 第60页 |
| 2.5 酶学性质分析 | 第60-61页 |
| 2.5.1 GPX活力测定 | 第60页 |
| 2.5.2 GST活力的测定 | 第60-61页 |
| 三、结果分析 | 第61-65页 |
| 3.1 GST-Sec的分离纯化 | 第61-62页 |
| 3.2 SECIS元件的引入GST结构的影响 | 第62-63页 |
| 3.3 sjGST和GST-Sec最适pH值 | 第63-64页 |
| 3.4 酶动力学分析 | 第64-65页 |
| 四、讨论 | 第65-67页 |
| 本章小结 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-71页 |
| 第三章 利用绿色荧光蛋白报告基因定量测定Escherichia coli体内UGA密码子的通读效率 | 第71-104页 |
| 第一节 前言 | 第71-72页 |
| 第二节 GFP报告基因系统的构建 | 第72-86页 |
| 一、实验材料 | 第72-73页 |
| 二、实验方法 | 第73-78页 |
| 2.1 质粒的提取 | 第73页 |
| 2.2 gfp基因的获得 | 第73-75页 |
| 2.3 PCR扩增sel系列片段 | 第75-76页 |
| 2.4 PCR扩增sel-gfp系列片段 | 第76-77页 |
| 2.5 selC基因的获得 | 第77-78页 |
| 三、结果分析 | 第78-85页 |
| 3.1 GFP报告载体的构建 | 第78-83页 |
| 3.1.1 gfp-3'基因片段的扩增 | 第79-80页 |
| 3.1.2 gfp-5'基因片段的扩增 | 第80页 |
| 3.1.3 gfp全长基因片段的扩增 | 第80-81页 |
| 3.1.4 sel系列基因片段的扩增 | 第81-82页 |
| 3.1.5 sel-gfp基因片段的扩增 | 第82-83页 |
| 3.1.6 sel-gfp基因片段和pET-32b载体的双酶切 | 第83页 |
| 3.1.7 DNA片段的连接及连接产物的转化 | 第83页 |
| 3.2 pBAD-SelC载体的构建 | 第83-85页 |
| 3.2.1 selC基因片段的扩增 | 第83-84页 |
| 3.2.2 selC基因片段和pBAD33载体的双酶切 | 第84页 |
| 3.2.3 DNA片段的连接及连接产物的转化 | 第84-85页 |
| 四、讨论 | 第85-86页 |
| 第三节 绿色荧光蛋白在Eschericoli coli中的表达及检测 | 第86-101页 |
| 一、实验材料 | 第86页 |
| 二、实验方法 | 第86-90页 |
| 2.1 质粒的转化 | 第86页 |
| 2.2 不同诱导表达条件对绿色荧光蛋白荧光的影响 | 第86-88页 |
| 2.2.1 IPTG在不同菌OD600值时起始诱导对GFP荧光的影响 | 第87页 |
| 2.2.2 不同IPTG诱导浓度对GFP荧光的影响 | 第87页 |
| 2.2.3 不同诱导表达温度对GFP荧光的影响 | 第87-88页 |
| 2.3 利用绿色荧光蛋白定量测定硒代半胱氨酸的通读效率 | 第88-89页 |
| 2.3.1 培养基中是否添加无机硒对硒代半胱氨酸的通读效率的影响 | 第88页 |
| 2.3.2 selC基因与报告基因gfp共表达对硒代半胱氨酸的通读效率的影响 | 第88页 |
| 2.3.3 selA，selB和selC基因与报告基因gfp共表达对硒代半胱氨酸的通读效率的影响 | 第88-89页 |
| 2.4 利用绿色荧光蛋白分析UGA密码子的体内编码 | 第89页 |
| 2.5 绿色荧光蛋白鉴定及荧光的测量 | 第89-90页 |
| 2.5.1 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶变性电泳 | 第89页 |
| 2.5.2 分子荧光测定 | 第89-90页 |
| 三、结果与讨论 | 第90-101页 |
| 3.1 不同诱导表达条件对绿色荧光蛋白荧光的影响 | 第90-97页 |
| 3.1.1 IPTG在不同菌OD600值时起始诱导对GFP荧光的影响 | 第90页 |
| 3.1.2 不同IPTG诱导浓度对GFP荧光的影响 | 第90-92页 |
| 3.1.3 不同诱导表达温度对GFP荧光的影响 | 第92-97页 |
| 3.2 利用绿色荧光蛋白定量测定硒代半胱氨酸的通读效率 | 第97-99页 |
| 3.3 利用绿色荧光蛋白分析UGA密码子的体内编码 | 第99-101页 |
| 本章小结 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-104页 |
| 第四章 selA，selB和selC基因对硒代半胱氨酸通读效率的影响 | 第104-133页 |
| 第一节 前言 | 第104-106页 |
| 第二节 selA，selB和selC基因表达载体的构建 | 第106-120页 |
| 一、实验材料 | 第106-107页 |
| 二、实验方法 | 第107-113页 |
| 2.1 质粒的提取 | 第107页 |
| 2.2 selA基因的获得及其表达载体的构建 | 第107-109页 |
| 2.3 selB基因的获得及其表达载体的构建 | 第109页 |
| 2.4 selAB基因的获得及其表达载体的构建 | 第109-112页 |
| 2.5 selB不同结构域基因的获得及其表达载体的构建 | 第112页 |
| 2.6 selC基因的获得及其表达载体pEXT-selC的构建 | 第112-113页 |
| 2.7 连接产物的鉴定 | 第113页 |
| 三、结果分析 | 第113-119页 |
| 3.1 pBAD-SelA载体的构建 | 第113-115页 |
| 3.2 pBAD-SelB载体的构建 | 第115页 |
| 3.3 pBAD-SelAB载体的构建 | 第115-116页 |
| 3.4 pBAD-SelAB(SD)载体的构建 | 第116-117页 |
| 3.5 pEXT-SelC载体的构建 | 第117页 |
| 3.6 pBAD-SelB13载体的构建 | 第117-118页 |
| 3.7 pBAD-SelB44载体的构建 | 第118-119页 |
| 四、讨论 | 第119-120页 |
| 第三节 selA，selB和selC基因在Eschericoli coli中的表达及它们对Sec插入效率的影响 | 第120-131页 |
| 一、实验材料 | 第120页 |
| 二、实验方法 | 第120-122页 |
| 2.1 质粒的转化 | 第120-121页 |
| 2.2 selA基因的诱导表达 | 第121页 |
| 2.3 selB基因的诱导表达 | 第121页 |
| 2.4 selA，selB和selC基因的共表达对Sec插入效率的影响 | 第121-122页 |
| 2.5 (?)半乳糖苷酶活力的检测 | 第122页 |
| 三、结果分析 | 第122-130页 |
| 3.1 selA基因的诱导表达 | 第122-123页 |
| 3.2 selB基因的诱导表达 | 第123页 |
| 3.3 selA和selB基因的共表达 | 第123-124页 |
| 3.4 selB基因不同结构域的诱导表达 | 第124-126页 |
| 3.5 selA，selB与selC基因的共表达对Sec插入效率的影响 | 第126-130页 |
| 3.5.1 单独的selA，selB与selC基因的共表达对Sec插入效率的影响 | 第126-128页 |
| 3.5.2 不同组合的selA，selB与selC基因的共表达对Sec插入效率的影响 | 第128-130页 |
| 四、讨论 | 第130-131页 |
| 本章小结 | 第131-132页 |
| 参考文献 | 第132-133页 |
| 第五章 文献综述 | 第133-193页 |
| 第一节 硒代半胱氨酸的生物合成 | 第133-141页 |
| 第二节 谷胱甘肽转硫酶 | 第141-150页 |
| 第三节 谷胱甘肽过氧化物酶 | 第150-154页 |
| 第四节 硫氧还蛋白折叠 | 第154-160页 |
| 第五节 绿色荧光蛋白 | 第160-166页 |
| 第六节 酶的再设计 | 第166-181页 |
| 参考文献 | 第181-193页 |
| 作者简历 | 第193-195页 |
| 致谢 | 第195-197页 |
| 中文摘要 | 第197-201页 |
| 英文摘要 | 第201页 |
