| 缩略语表 | 第6-9页 |
| 中文摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 前言 | 第16-18页 |
| 文献回顾 | 第18-30页 |
| 第一部分 靶向外源性dsRNA激活抗病毒固有免疫的分子机制研究 | 第30-62页 |
| 1. 实验材料与仪器 | 第31-35页 |
| 1.1. 菌种、质粒、病毒株和细胞系 | 第31页 |
| 1.2. 主要仪器 | 第31-32页 |
| 1.3. 主要试剂及配制方法 | 第32-35页 |
| 1.3.1. 试剂与材料 | 第32-34页 |
| 1.3.2. 试剂配制方法 | 第34-35页 |
| 2. 实验方法 | 第35-43页 |
| 2.1. 重组RLR受体dsCARE的原核表达与纯化 | 第35-36页 |
| 2.2. 病毒培养及其悬液制备 | 第36-37页 |
| 2.2.1. ADV-GFP的病毒悬液制备 | 第36页 |
| 2.2.2. RSV病毒悬液制备 | 第36-37页 |
| 2.3. TCID_(50)法测定病毒滴度 | 第37-38页 |
| 2.3.1. 带GFP标签的ADV病毒滴度测定 | 第37页 |
| 2.3.2. 野生型呼吸道合胞病毒(RSV)病毒滴度测定 | 第37-38页 |
| 2.4. 细胞活力测定 | 第38页 |
| 2.4.1. MTS比色法测定细胞活力 | 第38页 |
| 2.4.2. 台盼蓝染色法测定细胞活力 | 第38页 |
| 2.5. 细胞总RNA提取 | 第38-39页 |
| 2.6. 将mRNA反转录成cDNA | 第39页 |
| 2.7. 实时定量PCR(qPCR)检测IFN-β、IL-1β 和IL-18 | 第39-40页 |
| 2.8. ELISA检测IFN-β、IL-1β 和IL-18 | 第40-41页 |
| 2.9. 细胞转染 | 第41页 |
| 2.10. 流式细胞术检测细胞凋亡 | 第41页 |
| 2.11. 透射电镜观察 | 第41-42页 |
| 2.12. 蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP) | 第42页 |
| 2.13. 蛋白质免疫印迹(Western blotting) | 第42-43页 |
| 2.13.1. SDS-PAGE | 第42-43页 |
| 2.13.2. 免疫印迹 | 第43页 |
| 2.14. 统计学方法 | 第43页 |
| 3. 结果 | 第43-58页 |
| 3.1. 重组RLR受体dsCARE的抗病毒作用 | 第43-47页 |
| 3.1.1. dsCARE对重组腺病毒感染的保护作用 | 第44-45页 |
| 3.1.2. dsCARE对野生型呼吸道合胞病毒(RSV)感染的保护作用 | 第45-46页 |
| 3.1.3. 穿膜肽不是重组RLR受体dsCARE起抗病毒作用的功能结构域 | 第46-47页 |
| 3.2. dsCARE的抗病毒作用机制 | 第47-53页 |
| 3.2.1. dsCARE负调控IFN-β 的表达及其上游分子IRF-3 的活化 | 第47-48页 |
| 3.2.2. dsCARE促进炎性因子IL-1β 的表达但不影响IL-18 | 第48-49页 |
| 3.2.3. dsCARE通过诱导细胞死亡的方式清除病毒感染细胞 | 第49-51页 |
| 3.2.4. dsCARE不诱导细胞凋亡 | 第51-53页 |
| 3.3. dsCARE通过诱导程序性坏死发挥其抗病毒活性 | 第53-58页 |
| 3.3.1. dsCARE诱导坏死样形态学特征的细胞死亡 | 第53-55页 |
| 3.3.2. dsCARE诱导程序性坏死小体(necrosome)复合物形成 | 第55-57页 |
| 3.3.3. dsCARE诱导的Necroptosis需要RIP1、RIP3和Cathepsin D的参与 | 第57-58页 |
| 4. 讨论 | 第58-62页 |
| 第二部分 内源性dsRNA调控血管内皮功能紊乱的分子机制研究 | 第62-92页 |
| 1. 实验材料与仪器 | 第63-65页 |
| 1.1. 菌种、质粒、细胞和动物 | 第63页 |
| 1.2. 主要仪器 | 第63-64页 |
| 1.3. 主要试剂及配制方法 | 第64-65页 |
| 2. 实验方法 | 第65-75页 |
| 2.1. 小鼠血糖测定 | 第65-66页 |
| 2.2. 小鼠胸主动脉分离及石蜡包埋 | 第66页 |
| 2.3. 血管组织的免疫组织化学染色 | 第66-67页 |
| 2.4. 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离和培养 | 第67-68页 |
| 2.5. RNA免疫共沉淀(RNA-IP) | 第68页 |
| 2.6. cDNA文库构建 | 第68-70页 |
| 2.7. 重组质粒的构建 | 第70-73页 |
| 2.7.1. pcDNA3.1(+)-Alu | 第70页 |
| 2.7.2. pcDNA3.1(+)-Alu-LA与pcDNA3.1(+)-Alu-M的构建 | 第70-71页 |
| 2.7.3. 质粒提取 | 第71-72页 |
| 2.7.4. DNA凝胶电泳中目的片段的回收与纯化 | 第72页 |
| 2.7.5. 转化感受态细胞 | 第72-73页 |
| 2.8. 免疫荧光观察HUVEC中的dsRNA | 第73页 |
| 2.9. 斑点印记(Dot blotting)定量HUVEC中的dsRNA | 第73页 |
| 2.10. 实时定量PCR分析基因表达水平 | 第73-74页 |
| 2.11. 细胞内ROS测定 | 第74-75页 |
| 2.12. 蛋白质免疫印迹检(Western blotting)测蛋白表达水平 | 第75页 |
| 3. 结果 | 第75-89页 |
| 3.1. 体外和体内高血糖模型的建立 | 第75-76页 |
| 3.2. 高血糖诱导小鼠动脉内皮产生dsRNA | 第76-77页 |
| 3.3. 体外高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)产生dsRNA | 第77-78页 |
| 3.4. 通过RNA-IP鉴定HUVEC中产生的dsRNA是Alu RNA Sc亚家族 | 第78-80页 |
| 3.5. Alu RNA 促进活性氧簇(ROS)的产生 | 第80-82页 |
| 3.6. Alu RNA促进炎性因子IL-1β 的表达 | 第82-83页 |
| 3.7. Alu RNA负调控eNOS的表达 | 第83页 |
| 3.8. Alu RNA负调控SOD2的表达 | 第83-84页 |
| 3.9. Alu RNA激活NFκB信号通路 | 第84-85页 |
| 3.10. Alu RNA通过NFκB通路影响eNOS、SOD2和炎性因子IL-1β 的表达 | 第85-87页 |
| 3.11. Alu RNA功能缺失突变体的构建 | 第87-88页 |
| 3.12. Alu RNA在转录水平和翻译水平对目标基因的负调控作用 | 第88-89页 |
| 4. 讨论 | 第89-92页 |
| 小结 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-100页 |
| 附录 | 第100-103页 |
| 个人简历和研究成果 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104页 |
