| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩写表 | 第17-20页 |
| 第一部分 基于Procaspase-8 DEDs的原核表达体系研究 | 第20-103页 |
| 第一章 绪论 | 第20-29页 |
| 1.1 TRAIL诱导的凋亡通路 | 第21-22页 |
| 1.1.1 外源途径 | 第21页 |
| 1.1.2 内源途径 | 第21-22页 |
| 1.2 阿尔茨海默病(AD) | 第22-23页 |
| 1.3 细胞存亡调控蛋白Procaspase-8、c-FLIP | 第23-26页 |
| 1.3.1 Procaspase-8的结构 | 第24页 |
| 1.3.2 Procaspase-8的功能 | 第24-25页 |
| 1.3.3 c-FLIP的结构 | 第25页 |
| 1.3.4 c-FLIP的功能 | 第25-26页 |
| 1.3.5 c-FLIP与Procaspase-8的关系 | 第26页 |
| 1.4 研究的目的和意义 | 第26-28页 |
| 1.5 本课题研究路线 | 第28-29页 |
| 第二章 procaspase-8 DEDs相关原核表达质粒的构建 | 第29-74页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-32页 |
| 2.1.1 菌株和载体 | 第29-30页 |
| 2.1.2 主要实验仪器和材料 | 第30页 |
| 2.1.3 主要实验药品 | 第30-31页 |
| 2.1.4 主要试剂配制 | 第31-32页 |
| 2.2 实验方法与步骤 | 第32-41页 |
| 2.2.1 目的片段procaspase-8 DEDs基因序列的获取 | 第32-36页 |
| 2.2.1.1 引物设计 | 第32-35页 |
| 2.2.1.2 PCR反应 | 第35-36页 |
| 2.2.1.3 PCR产物纯化 | 第36页 |
| 2.2.2 野生型procaspase-8 DEDs克隆载体的构建 | 第36-40页 |
| 2.2.2.1 提取pET-28a(+)质粒 | 第36-37页 |
| 2.2.2.2 pET-28a(+)和procaspase-8 DEDs的双酶切反应 | 第37页 |
| 2.2.2.3 胶回收酶切后的线性化procaspase-8 DEDs和pET-28a(+) | 第37-38页 |
| 2.2.2.4 procaspase-8 DEDs与pET-28a(+)的连接反应 | 第38-39页 |
| 2.2.2.5 重组载体pET-28a(+)-procaspase-8 DEDs的转化 | 第39页 |
| 2.2.2.6 挑取单克隆: | 第39页 |
| 2.2.2.7 菌液PCR、酶切验证以及测序保菌 | 第39-40页 |
| 2.2.3 野生型procaspase-8 DEDs原核表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.3.1 提取pET-28a(+)-procaspase-8 DEDs质粒 | 第40-41页 |
| 2.2.3.2 pET-28a(+) -procaspase-8 DEDs质粒的转化 | 第41页 |
| 2.2.3.3 菌落PCR及测序保菌 | 第41页 |
| 2.3 实验结果及讨论 | 第41-46页 |
| 2.3.1 野生型procaspase-8 DEDs序列扩增结果 | 第41-42页 |
| 2.3.2 菌落PCR鉴定野生型重组质粒pET-28a(+)-procaspase-8DEDs | 第42-43页 |
| 2.3.3 酶切验证野生型重组质粒pET-28a(+)-procaspase-8DEDs | 第43-44页 |
| 2.3.4 测序验证野生型重组质粒pET-28a(+)-procaspase-8DEDs | 第44-46页 |
| 2.4 procaspase-8 DEDs相关突变体原核质粒载体构建及表达菌株获得 | 第46-74页 |
| 2.4.1 四种procaspase-8 DEDs原核突变体质粒载体构建 | 第46-57页 |
| 2.4.1.1 突变体质粒构建的基本原理 | 第46-47页 |
| 2.4.1.2 突变引物设计 | 第47-48页 |
| 2.4.1.3 PCR反应 | 第48-52页 |
| 2.4.1.4 四种procaspase-8 DEDs突变基因片段的纯化 | 第52-53页 |
| 2.4.1.5 四种procaspase-8 DED突变基因片段与空载pET-28a(+)质粒双酶切 | 第53-54页 |
| 2.4.1.6 胶回收酶切后的线性化的四种突变体procaspase-8 DEDs基因片段和pET-28a(+)片段 | 第54页 |
| 2.4.1.7 四种突变体procaspase-8 DEDs基因片段与pET-28a(+)的连接反应 | 第54-55页 |
| 2.4.1.8 四种突变pET-28a(+)-procaspase-8 DEDs质粒的转化 | 第55-56页 |
| 2.4.1.9 挑取单克隆 | 第56页 |
| 2.4.1.10 菌液PCR、酶切验证以及测序保菌 | 第56-57页 |
| 2.4.2 四种突变procaspase-8 DEDs原核表达菌株的获得 | 第57页 |
| 2.4.2.1 四种原核突变质粒的提取 | 第57页 |
| 2.4.2.2 四种原核突变质粒的转化 | 第57页 |
| 2.4.2.3 菌落PCR及测序保菌 | 第57页 |
| 2.4.3 实验结果与讨论 | 第57-74页 |
| 2.4.3.1 四种突变procaspase-8 DEDs序列扩增结果 | 第57-58页 |
| 2.4.3.2 菌落PCR鉴定四种突变procaspase-8 DEDs序列扩增结果 | 第58-59页 |
| 2.4.3.3 酶切验证四种procaspase-8 DEDs突变重组质粒 | 第59-61页 |
| 2.4.3.4 测序验证四个突变procaspase-8 DEDs质粒 | 第61-74页 |
| 第三章 蛋白诱导表达 | 第74-89页 |
| 3.1 实验材料 | 第75-79页 |
| 3.1.1 菌种 | 第75页 |
| 3.1.2 主要实验仪器和实验材料 | 第75-76页 |
| 3.1.3 主要实验药品 | 第76-77页 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 | 第77-79页 |
| 3.2 实验方法与步骤 | 第79-85页 |
| 3.2.1 五种Procaspase-8 DEDs蛋白的诱导表达及诱导条件的筛选 | 第79-85页 |
| 3.2.1.1 考马斯亮蓝R250染色 | 第80-83页 |
| 3.2.1.2 蛋白免疫印迹(Western-blotting) | 第83-85页 |
| 3.3 实验结果和讨论 | 第85-89页 |
| 第四章 Procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)蛋白的纯化与浓缩 | 第89-102页 |
| 4.1 实验材料 | 第89-93页 |
| 4.1.1 菌种 | 第89页 |
| 4.1.2 主要实验仪器和材料 | 第89-90页 |
| 4.1.3 主要实验药品 | 第90-92页 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 | 第92-93页 |
| 4.2 实验方法与步骤 | 第93-97页 |
| 4.2.1 利用镍柱纯化蛋白 | 第93-94页 |
| 4.2.1.1 蛋白的纯化 | 第93-94页 |
| 4.2.2 Procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)蛋白的浓缩 | 第94-97页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第97-102页 |
| 4.3.1 蛋白纯化结果 | 第97-98页 |
| 4.3.2 蛋白浓缩后的结果鉴定 | 第98-100页 |
| 4.3.3 蛋白浓缩结果的分析 | 第100-102页 |
| 第五章 第一部分小结 | 第102-103页 |
| 第二部分 肿瘤药物筛选细胞系研究 | 第103-153页 |
| 第一章 绪论 | 第103-107页 |
| 1.1 TRAIL凋亡通路与Procaspase-8的关系 | 第103-104页 |
| 1.2 Procaspase-8蛋白的结构与功能 | 第104-105页 |
| 1.3 REFI技术 | 第105页 |
| 1.4 本实验研究的目的 | 第105-106页 |
| 1.5 本实验研究路线 | 第106-107页 |
| 第二章 Procaspase-8 DEDs-GFP细胞系的构建 | 第107-134页 |
| 2.1 实验材料 | 第107-111页 |
| 2.1.1 载体、菌种和细胞 | 第107页 |
| 2.1.2 实验仪器与材料 | 第107-108页 |
| 2.1.3 主要实验药品 | 第108页 |
| 2.1.4 主要试剂配制 | 第108-111页 |
| 2.2 实验步骤与方法 | 第111-115页 |
| 2.2.1 目标条带获取与引物设计 | 第111-113页 |
| 2.2.2 PCR反应 | 第113页 |
| 2.2.3 PCR产物纯化 | 第113-115页 |
| 2.3 procaspase-8 DEDs真核克隆载体的构建 | 第115-120页 |
| 2.3.1 提取pCMV6-AC-GFP质粒 | 第115页 |
| 2.3.2 pCMV6-AC-GFP和procaspase-8 DEDs的双酶切反应 | 第115-116页 |
| 2.3.3 胶回收酶切后的线性化procaspase-8 DEDs和pCMV6-AC-GFP | 第116-117页 |
| 2.3.4 procaspase-8 DEDs与pCMV6-AC-GFP的连接反应 | 第117-118页 |
| 2.3.5 重组载体pCMV6-procaspase-8 DEDs-GFP的转化 | 第118页 |
| 2.3.6 挑取单克隆 | 第118-119页 |
| 2.3.7 菌液PCR、酶切验证以及测序保菌 | 第119-120页 |
| 2.4 细胞实验 | 第120-127页 |
| 2.4.1 pCMV6-procaspase-8 DEDs-GFP-去内毒素真核质粒的提取 | 第120-121页 |
| 2.4.2 HCT116细胞的复苏 | 第121-122页 |
| 2.4.3 HCT116细胞的传代 | 第122-123页 |
| 2.4.4 HCT116细胞的冻存 | 第123-124页 |
| 2.4.5 质粒pCMV6-procaspase-8 DEDs-GFP转染 | 第124-127页 |
| 2.5 实验结果 | 第127-132页 |
| 2.5.1 procaspase-8 DEDs序列扩增结果 | 第127-128页 |
| 2.5.2 菌液PCR鉴定procaspase-8 DEDs真核质粒 | 第128-129页 |
| 2.5.3 双酶切验证真核重组质粒pCMV6-procaspase-8 DEDs-GFP | 第129页 |
| 2.5.4 测序验证重组质粒pCMV6-procaspase-8 DEDs-GFP | 第129-131页 |
| 2.5.5 HCT116细胞转染结果 | 第131-132页 |
| 讨论 | 第132-134页 |
| 第三章 突变蛋白Procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)-GFP改善荧光聚集现象 | 第134-146页 |
| 3.1 实验材料 | 第134页 |
| 3.2 实验步骤与方法 | 第134页 |
| 3.3 procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)真核克隆载体的构建 | 第134-135页 |
| 3.4 细胞实验 | 第135页 |
| 3.5 实验结果 | 第135-144页 |
| 3.5.1 procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)序列扩增结果 | 第135-136页 |
| 3.5.2 菌液PCR鉴定procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)真核质粒 | 第136页 |
| 3.5.3 双酶切验证真核重组质粒pCMV6-procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)-GFP | 第136-137页 |
| 3.5.4 测序验证重组质粒pCMV6-procaspase-8DEDs~(F122GL123GI128D)-GFP | 第137-143页 |
| 3.5.5 HCT116细胞转染结果 | 第143-144页 |
| 讨论 | 第144-146页 |
| 第四章 转染procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)-gfp质粒的细胞株初步筛药验证 | 第146-148页 |
| 4.1 实验材料 | 第146页 |
| 4.2 细胞实验 | 第146页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第146-148页 |
| 第五章 G418对转染procaspase-8 DEDs~(F122GL123GI128D)-gfp真核质粒细胞株进行筛选 | 第148-152页 |
| 5.1 实验材料 | 第148页 |
| 5.2 细胞实验 | 第148页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第148-151页 |
| 讨论 | 第151-152页 |
| 第六章 第二部分小结 | 第152-153页 |
| 参考文献 | 第153-160页 |
| 致谢 | 第160-161页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 | 第161-162页 |
| 附录B 其他需要说明的内容 | 第162页 |
