| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 符号说明 | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-24页 |
| 1.1 引言 | 第12页 |
| 1.2 拟除虫菊酯类农药及其微生物降解研究 | 第12-15页 |
| 1.2.1 拟除虫菊酯的特性及其应用现状 | 第12-13页 |
| 1.2.2 拟除虫菊酯类农药的微生物降解 | 第13-14页 |
| 1.2.3 拟除虫菊酯类农药的微生物降解途径研究 | 第14-15页 |
| 1.3 拟除虫菊酯降解酶的研究 | 第15-20页 |
| 1.3.1 拟除虫菊酯降解酶的来源及性质 | 第15页 |
| 1.3.2 拟除虫菊酯降解酶的克隆和异源表达研究现状 | 第15-17页 |
| 1.3.3 蛋白质异源表达 | 第17-20页 |
| 1.4 荧光定量PCR技术研究现状 | 第20-22页 |
| 1.4.1 实时荧光定量PCR的原理及分类 | 第20页 |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR在多领域的应用 | 第20-22页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第22-24页 |
| 1.5.1 研究的目的和意义 | 第22页 |
| 1.5.2 本文的主要工作 | 第22-24页 |
| 第二章 氯氰菊酯降解酶的基因克隆 | 第24-40页 |
| 2.1 材料和仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.1 实验设备与型号 | 第24页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第24-25页 |
| 2.1.3 培养基 | 第25页 |
| 2.1.4 试剂盒、克隆用酶及其他试剂 | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-29页 |
| 2.2.1 菌株GF31基因组的提取和纯化回收 | 第25页 |
| 2.2.2 PCR扩增菊酯降解酶基因APs | 第25-28页 |
| 2.2.3 重组质粒APs-pET28a/pET30a/pET32a的构建及鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.4 APs基因工程表达菌的构建及鉴定 | 第29页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第29-39页 |
| 2.3.1 GF31基因组DNA提取 | 第29页 |
| 2.3.2 氯氰菊酯降解酶基因APs的TA克隆及鉴定 | 第29-31页 |
| 2.3.3 构建重组质粒APs-pET28a/pET30 pET32a | 第31-35页 |
| 2.3.4 APs氨基酸序列比对 | 第35-37页 |
| 2.3.5 APs基因工程表达菌的构建及鉴定 | 第37-39页 |
| 2.4 本章小结 | 第39-40页 |
| 第三章 氯氰菊酯降解酶的表达、纯化及酶活测定 | 第40-55页 |
| 3.1 材料和仪器 | 第40-41页 |
| 3.1.1 实验仪器及生产厂家 | 第40页 |
| 3.1.2 菌株与质粒 | 第40-41页 |
| 3.1.3 培养基 | 第41页 |
| 3.1.4 蛋白电泳试剂及其他试剂 | 第41页 |
| 3.2 实验方法 | 第41-47页 |
| 3.2.1 相关溶液的配制 | 第41页 |
| 3.2.2 工程菌的培养和诱导蛋白的产生 | 第41-42页 |
| 3.2.3 SDS-PAGE蛋白电泳步骤 | 第42-43页 |
| 3.2.4 Ni-NTA纯化 | 第43-44页 |
| 3.2.5 APs降解酶活力的检测 | 第44-47页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第47-54页 |
| 3.3.1 BL21 (DE3)中蛋白表达情况 | 第47-49页 |
| 3.3.2 Rosseta (DE3)中蛋白表达情况 | 第49-51页 |
| 3.3.3 Rosseta-gami中蛋白表达情况 | 第51-54页 |
| 3.4 本章小结 | 第54-55页 |
| 第四章 qRT-PCR相对定量方法的构建 | 第55-71页 |
| 4.1 实验材料与仪器设备 | 第55-56页 |
| 4.1.1 实验仪器及型号 | 第55-56页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第56页 |
| 4.1.3 菌株和培养基 | 第56页 |
| 4.2 实验方法 | 第56-59页 |
| 4.2.1 引物的设计与合成 | 第56-57页 |
| 4.2.2 16SrRNA-pET28a/pET30a/pET32a的构建 | 第57页 |
| 4.2.3 菌体培养 | 第57页 |
| 4.2.4 mRNA的提取及浓度鉴定 | 第57-58页 |
| 4.2.5 第一链cDNA的合成 | 第58页 |
| 4.2.6 荧光定量PCR程序的设定 | 第58页 |
| 4.2.7 检测工程菌中目的基因APS相对于GF31中APs的表达水平变化 | 第58-59页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第59-69页 |
| 4.3.1 16S rRNA-pET28a/pET30a的构建 | 第59页 |
| 4.3.2 RNA质量的检验 | 第59-60页 |
| 4.3.3 APs和16S rRNA引物退火温度的选择 | 第60页 |
| 4.3.4 引物特异性分析 | 第60-61页 |
| 4.3.5 扩增曲线分析 | 第61-62页 |
| 4.3.6 绘制标准曲线 | 第62-69页 |
| 4.3.7 工程菌中目的基因APs相对于GF31中APs的表达水平变化 | 第69页 |
| 4.4 小结 | 第69-71页 |
| 第五章 结论与展望 | 第71-73页 |
| 5.1 主要结论 | 第71页 |
| 5.2 展望 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文目录 | 第81页 |
