| 英文缩略词表 | 第9-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 第一部分 酰基化甾体糖苷的生物合成及活性鉴定 | 第16-150页 |
| 第一章 前言 | 第16-21页 |
| 1.1 概述 | 第16-17页 |
| 1.2 甾体糖基转移酶的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.3 甾体糖基转移酶对植物生长的作用 | 第18-19页 |
| 1.4 植物SGT催化特点及位点立体选择性 | 第19页 |
| 1.5 甾体糖基转移酶催化形成甾体糖苷药理作用 | 第19-20页 |
| 1.6 甾体糖苷酰基转移酶研究进展 | 第20页 |
| 1.7 小结与讨论 | 第20-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-29页 |
| 2.1 主要仪器设备及生产厂家 | 第21-22页 |
| 2.2 实验材料 | 第22-24页 |
| 2.2.1 标准品及常用试剂 | 第22页 |
| 2.2.1.1 标准品及底物 | 第22页 |
| 2.2.1.2 常用生化试剂 | 第22页 |
| 2.2.2 常见溶液配方 | 第22-24页 |
| 2.2.2.1 DNA电泳缓冲液(50×Tris-TAE) | 第22页 |
| 2.2.2.2 培养基配方 | 第22页 |
| 2.2.2.3 蛋白变性电泳SDS-PAGE所涉及溶液 | 第22-23页 |
| 2.2.2.4 蛋白染色:银染试剂 | 第23页 |
| 2.2.2.5 蛋白纯化相关溶液 | 第23页 |
| 2.2.2.6 Western-Blot相关溶液配方 | 第23-24页 |
| 2.3 植物材料 | 第24页 |
| 2.4 抗生素的配制 | 第24页 |
| 2.5 试剂盒及酶等生化试剂 | 第24页 |
| 2.6 菌株及质粒 | 第24-25页 |
| 2.7 常用实验方法 | 第25-29页 |
| 2.7.1 感受态制备方法(CaCl_2法) | 第25页 |
| 2.7.2 克隆载体连接 | 第25页 |
| 2.7.3 大肠杆菌的转化 | 第25页 |
| 2.7.4 重组子的筛选 | 第25-26页 |
| 2.7.5 重组蛋白的诱导表达 | 第26页 |
| 2.7.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第26-27页 |
| 2.7.7 蛋白染色—银染法 | 第27页 |
| 2.7.8 蛋白纯化及超滤 | 第27-28页 |
| 2.7.9 Western-Blot(蛋白免疫印迹)方法 | 第28-29页 |
| 第三章 桑多斯虎眼万年青甾体糖基转移酶基因克隆及序列分析 | 第29-40页 |
| 3.1 实验方法 | 第29-32页 |
| 3.1.1 桑多斯虎眼万年青转录组序列分析 | 第29页 |
| 3.1.2 桑多斯虎眼万年青cDNA的合成及OsGTs基因的克隆 | 第29-30页 |
| 3.1.3 生物信息学分析 | 第30-31页 |
| 3.1.4 表达载体构建 | 第31-32页 |
| 3.1.4.1 质粒提取 | 第31页 |
| 3.1.4.2 载体酶切 | 第31-32页 |
| 3.1.4.3 基因片段扩增 | 第32页 |
| 3.1.4.4 In-Fusion技术快速连接 | 第32页 |
| 3.2 实验结果 | 第32-39页 |
| 3.2.1 桑多斯虎眼万年青转录组序列分析 | 第32-33页 |
| 3.2.2 OsGTs的克隆 | 第33-35页 |
| 3.2.3 OsSGT1的生物信息学分析 | 第35-38页 |
| 3.2.3.1 OsSGT1 ORF预测及其理论编码蛋白的理化性质预测 | 第35页 |
| 3.2.3.2 OsSGT1跨膜域及蛋白性质预测 | 第35-36页 |
| 3.2.3.3 OsSGT1结构域预测及序列一致性分析 | 第36-38页 |
| 3.2.4 OsGTs表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第39-40页 |
| 第四章 甾体糖基转移酶(OSSGT1)的表达及功能鉴定 | 第40-67页 |
| 4.1 实验方法 | 第40-45页 |
| 4.1.1 OsSGT1重组蛋白的诱导表达及检测 | 第40页 |
| 4.1.2 OsSGT1的纯化及超滤 | 第40-41页 |
| 4.1.3 OsSGT1蛋白定量 | 第41页 |
| 4.1.4 OsSGT1的功能鉴定 | 第41-43页 |
| 4.1.4.1 功能鉴定及底物特异性研究 | 第42-43页 |
| 4.1.4.2 OsSGT1催化甾醇类化合物立体选择性研究 | 第43页 |
| 4.1.4.3 OsSGT1催化甾体类化合物糖基供体特异性研究 | 第43页 |
| 4.1.5 OsSGT1催化的最适pH、最适温度及二价金属离子影响分析 | 第43-45页 |
| 4.1.5.1 糖基化反应催化所需最适温度 | 第43-44页 |
| 4.1.5.2 糖基化反应催化所需最适pH | 第44页 |
| 4.1.5.3 二价金属离子对OsSGT1催化的糖基化反应的影响 | 第44页 |
| 4.1.5.4 OsSGT1催化糖基化供体UDP-Glc的酶促动力学参数测定 | 第44页 |
| 4.1.5.5 OsSGT1催化不同甾体糖基受体的转化效率 | 第44-45页 |
| 4.2 实验结果 | 第45-65页 |
| 4.2.1 OsSGT1重组蛋白的检测 | 第45-48页 |
| 4.2.2 OsSGT1的功能验证 | 第48-60页 |
| 4.2.2.1 OsSGT1受体底物特异性研究 | 第48页 |
| 4.2.2.2 OsSGT1酶促反应产物的HPLC检测及化合物结构鉴定 | 第48-60页 |
| 4.2.3 OsSGT1糖基供体偏好性研究 | 第60-62页 |
| 4.2.4 OsSGT1催化不同甾体糖基受体的转化效率 | 第62页 |
| 4.2.5 OsSGT1催化糖基化反应的最适温度及最适pH | 第62-64页 |
| 4.2.5.1 OsSGT1催化糖基化反应的最适温度 | 第62-63页 |
| 4.2.5.2 OsSGT1催化糖基化反应的最适pH | 第63页 |
| 4.2.5.3 二价金属离子对OsSGT1催化糖基化反应的影响 | 第63-64页 |
| 4.2.6 OsSGT1催化底物糖基化反应的酶促动力学参数测定 | 第64-65页 |
| 4.2.6.1 产物睾酮17β-O-葡萄糖苷标准品标准曲线的绘制 | 第64页 |
| 4.2.6.2 OsSGT1催化UDP-Glc和睾酮的酶促动力学参数测定 | 第64-65页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第65-67页 |
| 第五章 乙酰化甾体糖苷的生物合成及其应用 | 第67-93页 |
| 5.1 大肠杆菌BL21 (DE3)乙酰基转移酶的克隆 | 第68-77页 |
| 5.1.1 实验方法 | 第68-72页 |
| 5.1.1.1 甾体糖苷乙酰化产物的发现及来源 | 第68-69页 |
| 5.1.1.2 大肠杆菌基因组的生物信息学分析 | 第69-71页 |
| 5.1.1.3 EOAT的基因克隆 | 第71页 |
| 5.1.1.4 表达载体构建 | 第71-72页 |
| 5.1.2 实验结果 | 第72-77页 |
| 5.1.2.1 甾体糖苷乙酰化产物的发现及来源 | 第72-74页 |
| 5.1.2.2 大肠杆菌基因组的生物信息学分析 | 第74-75页 |
| 5.1.2.3 EOAT的基因克隆 | 第75-76页 |
| 5.1.2.4 表达载体的构建 | 第76-77页 |
| 5.2 EOAT2和EOAT3大肠杆菌诱导表达及纯酶功能鉴定 | 第77-79页 |
| 5.2.1 实验方法 | 第77页 |
| 5.2.1.1 EOAT重组蛋白的诱导表达 | 第77页 |
| 5.2.1.2 EOAT2和EOAT2的纯化及超滤 | 第77页 |
| 5.2.2 实验结果 | 第77-79页 |
| 5.2.2.1 EOAT重组蛋白的诱导表达及纯化 | 第77-78页 |
| 5.2.2.2 EOAT融合蛋白的蛋白定量 | 第78-79页 |
| 5.3 融合蛋白EOAT2和EOAT3的功能鉴定及酶学性质研究 | 第79-87页 |
| 5.3.1 实验方法 | 第79-81页 |
| 5.3.1.1 EOAT2和EOAT3的功能鉴定 | 第79页 |
| 5.3.1.2 EOAT2催化酰基化反应的底物特异性研究 | 第79-80页 |
| 5.3.1.3 EOAT2最适pH、最适温度及二价金属离子的影响 | 第80页 |
| 5.3.1.4 EOAT2催化甾体糖苷乙酰化反应酶促动力学参数测定 | 第80-81页 |
| 5.3.2 实验结果 | 第81-87页 |
| 5.3.2.1 EOAT2和EOAT3的功能鉴定 | 第81-83页 |
| 5.3.2.2 EOAT2催化酰基化反应的底物特异性研究 | 第83页 |
| 5.3.2.3 EOAT2最适pH、最适温度及二价金属离子的影响 | 第83-86页 |
| 5.3.2.4 EOAT2催化甾体糖苷乙酰化反应酶促动力学参数测定 | 第86-87页 |
| 5.4 EOAT2催化甾体糖苷的乙酰化位点选择性 | 第87-91页 |
| 5.4.1 实验方法 | 第87-88页 |
| 5.4.1.1 甾体糖苷形成不同乙酰基单酰化产物 | 第87页 |
| 5.4.1.2 睾酮糖苷乙酰化产物的制备及位点选择性 | 第87-88页 |
| 5.4.2 实验结果 | 第88-91页 |
| 5.4.2.1 甾体糖苷形成不同乙酰基单酰化产物 | 第88-89页 |
| 5.4.2.2 睾酮糖苷乙酰化产物的制备及位点选择性 | 第89-91页 |
| 5.5 小结与讨论 | 第91-93页 |
| 第六章 全文总结与讨论 | 第93-95页 |
| 6.1 主要内容和意义 | 第93-94页 |
| 6.1.1 糖基转移酶基因的克隆和表达 | 第93页 |
| 6.1.2 甾体糖基转移酶的功能鉴定 | 第93页 |
| 6.1.3 OsSGT1的酶学性质研究 | 第93页 |
| 6.1.4 甾体糖苷的生物合成与活性研究 | 第93-94页 |
| 6.2 论文创新点 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-103页 |
| 附录 | 第103-150页 |
| 第二部分 来源于虎眼万年青的鲨烯合酶基因的克隆、表达及功能鉴定 | 第150-177页 |
| 第一章 前言 | 第150-152页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第152-154页 |
| 2.1 实验材料 | 第152-153页 |
| 2.1.1 质粒,菌株 | 第152页 |
| 2.1.2 植物材料 | 第152页 |
| 2.1.3 生化试剂和酶 | 第152-153页 |
| 2.2 本实验涉及溶液配方和操作 | 第153-154页 |
| 第三章 实验方法 | 第154-156页 |
| 3.1 OCSQS1的CDNA克隆和生物信息学分析 | 第154页 |
| 3.2 OCSQS1的原核诱导表达 | 第154页 |
| 3.3 OCSQS1截短突变 | 第154-155页 |
| 3.4 OCSQS1活性检测 | 第155-156页 |
| 3.4.1 细胞粗提物中鲨烯合酶活性分析 | 第155页 |
| 3.4.2 纯化的OcSQS1活性分析 | 第155-156页 |
| 第四章 实验结果 | 第156-166页 |
| 4.1 RNA-SEQ数据库中筛选虎眼万年青UNIGENES | 第156-159页 |
| 4.1.1 RNA-Seq数据库中筛选虎眼万年青Unigenes | 第156页 |
| 4.1.2 cDNA克隆和序列分析 | 第156-159页 |
| 4.2 OCSQS1的原核诱导表达 | 第159-163页 |
| 4.2.1 全长OcSQS1基因pETHis-OcSQS1质粒诱导 | 第159-160页 |
| 4.2.2 全长OcSQS1基因共表达分子伴侣质粒诱导 | 第160页 |
| 4.2.3 全长OcSQS1基因大肠杆菌周质空间表达 | 第160-162页 |
| 4.2.4 OcSQS1的截短突变 | 第162-163页 |
| 4.3 OCSQS1活性的验证 | 第163-166页 |
| 第五章 实验结果 | 第166页 |
| 第六章 全文总结与讨论 | 第166-167页 |
| 参考文献 | 第167-171页 |
| 附录 | 第171-177页 |
| 致谢 | 第177-178页 |
| 个人简介 | 第178-179页 |
