| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 综述部分 | 第13-38页 |
| 第一章 a-乳白蛋白研究进展 | 第13-21页 |
| 1.1 α-乳白蛋白的结构与功能 | 第13-15页 |
| 1.1.1 a-乳白蛋白与钙离子的结合 | 第14页 |
| 1.1.2 a-乳白蛋白与其他金属离子的结合 | 第14页 |
| 1.1.3 a-乳白蛋白与 β-1,4 糖基转移酶复合物 | 第14-15页 |
| 1.2 a-乳白蛋白的生物学作用 | 第15-18页 |
| 1.2.1 提高乳汁产量 | 第16页 |
| 1.2.2 促进新生儿大脑发育及提高身体免疫力 | 第16页 |
| 1.2.3 控制肥胖患者体重 | 第16-17页 |
| 1.2.4 诱导肿瘤细胞凋亡 | 第17-18页 |
| 1.3 a-乳白蛋白在转基因动物乳汁中的表达 | 第18-21页 |
| 1.3.1 a-La在不同动物乳汁中的含量 | 第18-19页 |
| 1.3.2 通过基因组定点整合方法使转基因动物表达a-La | 第19-20页 |
| 1.3.3 通过基因组随机整合策略使转基因动物表达a-La | 第20-21页 |
| 第二章 基因打靶技术研究进展 | 第21-38页 |
| 2.1 DNA双链断裂引发的修复 | 第22-24页 |
| 2.1.1 非同源末端连接 | 第23页 |
| 2.1.2 同源重组 | 第23-24页 |
| 2.1.3 诱变修复 | 第24页 |
| 2.2 提高基因打靶效率的特异性核酸工程酶 | 第24-31页 |
| 2.2.1 锌指核酸酶技术 | 第25-27页 |
| 2.2.2 转录激活因子样效应物核酸酶 | 第27-28页 |
| 2.2.3 CRISPR-Cas 9 系统 | 第28-30页 |
| 2.2.4 核酸酶技术活性评估方法 | 第30-31页 |
| 2.3 基因打靶技术在生产转基因动物上的应用 | 第31-34页 |
| 2.3.1 制备药用蛋白 | 第31-32页 |
| 2.3.2 提高动物福利 | 第32-33页 |
| 2.3.3 提高动物乳产品品质 | 第33页 |
| 2.3.4 医学应用 | 第33-34页 |
| 2.4 基因打靶与转基因动物安全 | 第34-38页 |
| 2.4.1 靶基因失活对转基因动物影响 | 第34-35页 |
| 2.4.1 筛选标记基因对转基因动物影响 | 第35页 |
| 2.4.2 工程核酸酶技术的对转基因安全的影响 | 第35-38页 |
| 实验研究 | 第38-96页 |
| 第三章 靶向山羊BLG基因的TALENs及打靶载体的制备 | 第38-56页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第39页 |
| 3.1.1 材料 | 第39页 |
| 3.1.2 质粒和试剂 | 第39页 |
| 3.2 方法 | 第39-48页 |
| 3.2.1 奶山羊BLG位点的TALENs表达质粒的制备与鉴定 | 第39-40页 |
| 3.2.2 针对西农萨能奶山羊BLG位点的基因敲入载体构建 | 第40-44页 |
| 3.2.3 hLA在山羊乳腺上皮细胞上的表达验证 | 第44-48页 |
| 3.3 结果 | 第48-54页 |
| 3.3.1 TALENs表达质粒的制备及鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3.2 含hLA基因的打靶载体构建 | 第49-50页 |
| 3.3.3 hLA在山羊乳腺上皮细胞的表达验证 | 第50-54页 |
| 3.4 讨论 | 第54-55页 |
| 3.5 小结 | 第55-56页 |
| 第四章 人a-乳白蛋白基因整合入山羊BLG基因位点的基因打靶细胞筛选 | 第56-71页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第57页 |
| 4.1.1 材料 | 第57页 |
| 4.1.2 试剂 | 第57页 |
| 4.2 方法 | 第57-62页 |
| 4.2.1 原代山羊胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维培养 | 第57-58页 |
| 4.2.2 TALENs mRNA的制备 | 第58-59页 |
| 4.2.3 奶山羊成纤维细胞转染及抗药性细胞克隆筛选 | 第59-60页 |
| 4.2.4 PCR检测细胞克隆基因组中外源基因整合情况 | 第60-62页 |
| 4.2.4 山羊BLG双等位基因整合鉴定 | 第62页 |
| 4.3 结果 | 第62-69页 |
| 4.3.1 奶山羊胎儿成纤维及耳皮肤成纤维细胞培养 | 第62-63页 |
| 4.3.2 奶山羊成纤维细胞抗G418细胞克隆筛选 | 第63-64页 |
| 4.3.3 基因打靶细胞克隆筛选 | 第64-66页 |
| 4.3.4 BLG 双等位基因整合细胞克隆检测 | 第66-67页 |
| 4.3.5 ZFNs和TALENs介导的基因打靶效率比较 | 第67-69页 |
| 4.4 讨论 | 第69-70页 |
| 4.5 小结 | 第70-71页 |
| 第五章 应用体细胞核移植技术生产基因打靶奶山羊 | 第71-85页 |
| 5.1 材料和试剂 | 第72页 |
| 5.1.1 材料 | 第72页 |
| 5.1.2 质粒和试剂 | 第72页 |
| 5.2 方法 | 第72-76页 |
| 5.2.1 卵母细胞采集及体外培养 | 第72-73页 |
| 5.2.2 阳性基因打靶细胞准备 | 第73页 |
| 5.2.3 体细胞核移植 | 第73页 |
| 5.2.4 重组胚胎体外培养 | 第73页 |
| 5.2.5 重组胚胎移植及奶山羊妊娠检测 | 第73-74页 |
| 5.2.6 转基因奶山羊鉴定 | 第74-76页 |
| 5.3 结果 | 第76-82页 |
| 5.3.1 卵母细胞采集及体外成熟培养 | 第76页 |
| 5.3.2 重组卵母细胞体外成熟培养 | 第76-78页 |
| 5.3.3 胚胎移植及妊娠监测 | 第78-80页 |
| 5.3.4 转基因奶山羊鉴定 | 第80-82页 |
| 5.4 讨论 | 第82-83页 |
| 5.5 小结 | 第83-85页 |
| 第六章 基因打靶奶山羊乳汁分析 | 第85-96页 |
| 6.1 材料和试剂 | 第86页 |
| 6.1.1 材料 | 第86页 |
| 6.1.2 试剂 | 第86页 |
| 6.2 方法 | 第86-88页 |
| 6.2.1 基因打靶奶山羊（F0代）配种 | 第86页 |
| 6.2.2 F1代奶山羊的鉴定 | 第86页 |
| 6.2.3 基因打靶奶山羊乳汁采集 | 第86页 |
| 6.2.4 基因打靶奶山羊乳汁中各组份分析 | 第86页 |
| 6.2.5 基因打靶奶山羊乳汁SDS-PAGE检测 | 第86-87页 |
| 6.2.6 基因打靶奶山羊乳汁hLA检测 | 第87-88页 |
| 6.3 结果 | 第88-93页 |
| 6.3.1 F1代奶山羊鉴定 | 第88-90页 |
| 6.3.2 基因打靶奶山羊乳汁成分分析 | 第90页 |
| 6.3.3 基因打靶奶山羊乳清蛋白SDS-PAGE检测 | 第90-91页 |
| 6.3.4 基因打靶奶山羊乳汁中hLA检测 | 第91-93页 |
| 6.4 讨论 | 第93-94页 |
| 6.5 小结 | 第94-96页 |
| 结论 | 第96-97页 |
| 创新之处及进一步研究的内容 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-110页 |
| 附录 | 第110-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 作者简介 | 第118页 |
