| 中文摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-15页 |
| 英文缩略词表 | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-34页 |
| 综述一 BVDV研究现状 | 第17-24页 |
| 1.BVDV概况 | 第17页 |
| 2.BVDV流行病学 | 第17-18页 |
| 3.BVDV的分型 | 第18-19页 |
| 4.cp型和ncp型 | 第19-20页 |
| 5.BVDV的病原特性 | 第20页 |
| 6.BVDV基因组结构 | 第20-21页 |
| 7.BVDV的侵染过程 | 第21页 |
| 8.BVDV的致病机制 | 第21-22页 |
| 9.BVDV与凋亡 | 第22页 |
| 10.BVDV的持续性感染 | 第22-23页 |
| 11.BVDV防治现状 | 第23-24页 |
| 综述二 细胞凋亡的研究进展 | 第24-34页 |
| 1.凋亡的概述 | 第24-25页 |
| ·细胞凋亡的由来 | 第24页 |
| ·细胞凋亡的概念 | 第24页 |
| ·细胞凋亡的生物学特征 | 第24-25页 |
| ·引发细胞凋亡的因素 | 第25页 |
| ·抑制凋亡的抑制性因素 | 第25页 |
| 2 凋亡发生的重要途径 | 第25-27页 |
| ·由死亡受体介导的细胞凋亡途径 | 第26页 |
| ·线粒体介导的凋亡途径 | 第26-27页 |
| ·内质网介导的细胞凋亡路径 | 第27页 |
| 3 凋亡的发生机制 | 第27-28页 |
| 4 凋亡相关的蛋白分子 | 第28-30页 |
| ·BCL‐2 | 第28-29页 |
| ·Caspases | 第29-30页 |
| ·P53基因 | 第30页 |
| ·Apaf‐1 | 第30页 |
| 5 细胞凋亡的检测方法 | 第30-32页 |
| ·根据早期凋亡细胞形态变化采用的实验方法 | 第31页 |
| ·根据磷脂酰丝氨酸外翻可采用的实验方法 | 第31页 |
| ·根据线粒体跨膜电位（△Ym）的变化检测凋亡 | 第31页 |
| ·DNA片段化检测 | 第31页 |
| ·TUNEL检测法 | 第31-32页 |
| ·Caspase‐3 活性检测法 | 第32页 |
| 6 细胞凋亡与疾病的发生 | 第32页 |
| 7 细胞凋亡与microRNA | 第32-34页 |
| 第二章 实验研究 | 第34-71页 |
| 实验一 牛miR-193a的慢病毒载体构建及其初步鉴定[85] | 第34-43页 |
| 摘要 | 第34-35页 |
| 1 材料和方法 | 第35-38页 |
| ·材料与试剂 | 第35页 |
| ·载体 | 第35页 |
| ·主要试剂 | 第35页 |
| ·细胞 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-38页 |
| ·引物设计 | 第35-36页 |
| ·提取MDBK细胞全基因组DNA | 第36页 |
| ·pre‐miR‐193a和pre‐miR‐193a‐IN基因的克隆 | 第36页 |
| ·PCR扩增产物的胶回收及连接T载体 | 第36页 |
| ·制取大肠杆菌DH5α 感受态细胞 | 第36-37页 |
| ·转化，菌液PCR并送公司测序 | 第37页 |
| ·慢病毒重组载体的构建 | 第37页 |
| ·大提质粒 | 第37页 |
| ·重组慢病毒载体包装 | 第37-38页 |
| ·慢病毒毒液侵染MDBK细胞 | 第38页 |
| ·RT‐PCR检测miR‐193a的转录水平 | 第38页 |
| 2. 结果与分析 | 第38-41页 |
| ·pre‐miR‐193a‐IN和pre‐miR‐193a的克隆鉴定 | 第38-39页 |
| ·慢病毒重组载体的双酶切鉴定 | 第39-40页 |
| ·慢病毒重组载体的测序结果 | 第40页 |
| ·慢病毒重组载体的包装后鉴定 | 第40页 |
| ·慢病毒重组载体毒液侵染MDBK细胞后的鉴定 | 第40-41页 |
| ·RT‐PCR检测MDBK细胞mi R‐193a的转录水平 | 第41页 |
| 3 讨论 | 第41-42页 |
| 4.小结 | 第42-43页 |
| 实验二miR-193a靶向Bax并诱导细胞凋亡的分子机制研究 | 第43-57页 |
| 摘要 | 第43-44页 |
| 1 材料和方法 | 第44-49页 |
| ·材料与试剂 | 第44-45页 |
| ·载体 | 第44页 |
| ·主要试剂 | 第44-45页 |
| ·细菌和细胞 | 第45页 |
| ·方法 | 第45-49页 |
| ·引物的设计 | 第45-46页 |
| ·转染miR‐193a的模拟物和抑制剂进入MDBK细胞 | 第46页 |
| ·RT‐PCR检测BVDV的复制水平 | 第46页 |
| ·预测miR‐193a的靶基因 | 第46-47页 |
| ·Bax 3’UTR和Bax 3’UTR mutation的扩增 | 第47页 |
| ·构建含目的基因的双荧光素酶载体 | 第47页 |
| ·验证microRNA的靶基因 | 第47-48页 |
| ·过表达和抑制miR‐193a后RT‐PCR检测Bax的转录水平 | 第48页 |
| ·WB检测Bax的蛋白表达量 | 第48-49页 |
| ·细胞凋亡率的检测 | 第49页 |
| 2.结果与分析 | 第49-54页 |
| ·RT‐PCR检测过表达和抑制miR‐193a后BVDV的复制水平 | 第49-50页 |
| ·miR‐193a靶基因的预测结果 | 第50页 |
| ·Bax 3’UTR和Bax 3’UTR mutation的扩增结果 | 第50-51页 |
| ·双荧光素酶载体pmirGLO重组载体的验证 | 第51-52页 |
| ·验证miR‐193a凋亡相关的靶基因 | 第52页 |
| ·RT‐PCR检测过表达和抑制miR‐193a后Bax的转录水平 | 第52-53页 |
| ·Western bloting检测Bax的蛋白表达水平 | 第53页 |
| ·检测过表达和抑制miR‐193a后MDBK细胞凋亡率 | 第53-54页 |
| 3 讨论 | 第54-56页 |
| 4.小结 | 第56-57页 |
| 实验三：牛miR-193a基因启动子的预测和验证 | 第57-71页 |
| 摘要 | 第57-58页 |
| 1 材料和方法 | 第58-64页 |
| ·材料与试剂 | 第58-59页 |
| ·载体 | 第58页 |
| ·主要试剂 | 第58-59页 |
| ·细菌和细胞 | 第59页 |
| ·方法 | 第59-64页 |
| ·引物的设计 | 第59页 |
| ·MDBK细胞全基因组DNA的提取 | 第59页 |
| ·引物的扩增 | 第59-60页 |
| ·荧光素酶报告重组载体pGL3‐Basic‐gene的构建 | 第60页 |
| ·pGL3‐Basic‐gene转染 293T细胞并进行荧光验证 | 第60页 |
| ·设计甲基化检测引物 | 第60页 |
| ·提取BVDV感染和未感染的MDBK细胞全基因组DNA | 第60页 |
| ·甲基化BVDV感染和未感染的MDBK细胞全基因组 | 第60-61页 |
| ·miR‐193a甲基化检测引物的扩增 | 第61页 |
| ·miR‐193a启动子区域的甲基化程度的分析 | 第61页 |
| ·设计干扰甲基化位点的shRNA | 第61-62页 |
| ·shRNA的合链并构建慢病毒干扰载体 | 第62页 |
| ·包装慢病毒感染细胞 | 第62-63页 |
| ·提取感染shRNA‐慢病毒和对照组MDBK细胞mi RNA | 第63页 |
| ·RT‐PCR检测shRNA慢病毒干扰后miR‐193a的表达水平 | 第63页 |
| ·提取感染shRNA‐慢病毒和对照组MDBK细胞全基因组DNA | 第63页 |
| ·甲基化处理含shRNA‐慢病毒的MDBK全基因组 | 第63页 |
| ·shRNA‐慢病毒重组载体PCR扩增 | 第63页 |
| ·miR‐193a启动子区域的甲基化程度的分析 | 第63-64页 |
| 2.结果与分析 | 第64-69页 |
| ·193a‐P1/2 至 193a‐P5片段的克隆鉴定 | 第64页 |
| ·双酶切鉴定重组荧光素酶报告载体 | 第64-65页 |
| ·验证 293T细胞中pGL3‐Basic‐gene与启动子的作用 | 第65-66页 |
| ·甲基化检测引物miR‐193a‐1 和miR‐193a‐2 片段的克隆 | 第66页 |
| ·miR‐193a启动子区域的甲基化程度的分析结果 | 第66-67页 |
| ·shRNA的合链结果 | 第67页 |
| ·RT‐PCR检测shRNA慢病毒重组载体干扰后miR‐193a的表达水平 | 第67-68页 |
| ·甲基化分析结果 | 第68-69页 |
| 3 讨论 | 第69-70页 |
| 4.小结 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 创新点 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 作者简介 | 第82-83页 |
| 导师评阅表 | 第83页 |
