| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-13页 |
| 1 引言 | 第13-23页 |
| ·奶牛乳腺炎及防治的研究进展 | 第13-15页 |
| ·奶牛乳腺的组成结构 | 第13页 |
| ·引起奶牛乳腺炎的病原 | 第13页 |
| ·奶牛乳腺炎的致病机理与诊断 | 第13-14页 |
| ·奶牛乳腺炎的防治 | 第14-15页 |
| ·防御素的研究进展 | 第15-21页 |
| ·防御素的结构、分布与合成 | 第15-17页 |
| ·作用机制与生理功能 | 第17-18页 |
| ·表达调控 | 第18-21页 |
| ·牛防御素基因的研究 | 第21页 |
| ·应用前景 | 第21页 |
| ·本研究的目的意义 | 第21-23页 |
| 2 试验一 荷斯坦奶牛乳腺组织β-防御素基因cDNA的克隆与序列分析 | 第23-37页 |
| ·材料与方法 | 第23-30页 |
| ·材料 | 第23页 |
| ·仪器和试剂 | 第23页 |
| ·PCR引物的设计及合成 | 第23-24页 |
| ·荷斯坦奶牛乳腺组织RNA的提取与检测 | 第24-25页 |
| ·RT-PCR反应 | 第25-26页 |
| ·β-defensins基因重组质粒的筛选和鉴定原理 | 第26页 |
| ·乳腺组织β-防御素基因RT-PCR产物的回收 | 第26-27页 |
| ·连接反应 | 第27-28页 |
| ·连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第28页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第28页 |
| ·菌液PCR | 第28-29页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第29-30页 |
| ·RT-PCR产物的序列测定 | 第30页 |
| ·结果 | 第30-36页 |
| ·乳腺组织总RNA的检测结果 | 第30-31页 |
| ·乳腺组织RT-PCR扩增结果 | 第31-32页 |
| ·测序结果 | 第32-34页 |
| ·6种β-防御素序列分析结果 | 第34-35页 |
| ·荷斯坦奶牛乳腺组织6种β-防御素氨基酸序列的比较 | 第35-36页 |
| ·讨论 | 第36页 |
| ·小结 | 第36-37页 |
| 3 试验二 荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞培养与其内β-防御素的克隆 | 第37-50页 |
| ·材料与试剂 | 第37-38页 |
| ·材料 | 第37页 |
| ·仪器和试剂 | 第37-38页 |
| ·试验方法 | 第38-43页 |
| ·PCR引物的设计及合成 | 第38页 |
| ·乳腺上皮细胞的原代培养 | 第38-39页 |
| ·乳腺上皮细胞的纯化与传代培养 | 第39页 |
| ·乳腺上皮细胞的冻存与解冻复苏 | 第39-40页 |
| ·生长曲线绘制 | 第40页 |
| ·上皮细胞中期分裂相染色体的制备与核型分析 | 第40-41页 |
| ·荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞总RNA的提取及检测 | 第41页 |
| ·乳腺上皮细胞β-防御素基因的克隆 | 第41-43页 |
| ·结果 | 第43-48页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞的原代培养 | 第43-44页 |
| ·乳腺上皮细胞的纯化与传代 | 第44页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线 | 第44-45页 |
| ·乳腺上皮细胞核型分析 | 第45页 |
| ·乳腺上皮细胞α-酪蛋白基因扩增结果 | 第45-46页 |
| ·乳腺上皮细胞总RNA的检测结果 | 第46页 |
| ·乳腺上皮细胞cDNA序列PCR扩增结果 | 第46-47页 |
| ·测序结果及序列分析 | 第47-48页 |
| ·讨论 | 第48-49页 |
| ·乳腺上皮细胞的培养 | 第48页 |
| ·6种β-防御素基因的扩增 | 第48-49页 |
| ·小结 | 第49-50页 |
| 4 试验三 荷斯坦奶牛乳腺组织与上皮细胞β-防御素的差异表达 | 第50-63页 |
| ·材料与方法 | 第50-51页 |
| ·材料 | 第50页 |
| ·仪器和试剂 | 第50页 |
| ·PCR引物的设计及合成 | 第50-51页 |
| ·试验方法 | 第51-55页 |
| ·荷斯坦奶牛乳腺组织总RNA的提取及检测 | 第51页 |
| ·乳腺组织β-防御素反转录反应 | 第51-52页 |
| ·乳腺组织β-防御素荧光定量PCR反应 | 第52页 |
| ·乳腺上皮细胞培养 | 第52-53页 |
| ·快速提取乳腺上皮细胞总RNA | 第53页 |
| ·乳腺上皮细胞β-防御素表达 | 第53-54页 |
| ·基因表达定量方法 | 第54-55页 |
| ·数据统计分析 | 第55页 |
| ·结果 | 第55-60页 |
| ·β-actin扩增产物结果 | 第55页 |
| ·荧光定量RT-PCR扩增与熔解曲线 | 第55-58页 |
| ·荧光定量RT-PCR扩增效率曲线 | 第58-59页 |
| ·奶牛乳腺组织防御素的表达 | 第59页 |
| ·奶牛乳腺上皮细胞防御素的表达 | 第59-60页 |
| ·讨论 | 第60-62页 |
| ·β-actin的成功克隆 | 第60-61页 |
| ·6种β-防御素的差异表达 | 第61-62页 |
| ·小结 | 第62-63页 |
| 5 试验四荷斯坦奶牛乳腺细胞添加LPS后β-防御素的表达变化 | 第63-77页 |
| ·材料与方法 | 第63-64页 |
| ·材料 | 第63页 |
| ·仪器和试剂 | 第63页 |
| ·引物设计与合成 | 第63-64页 |
| ·试验方法 | 第64-65页 |
| ·乳腺上皮细胞培养 | 第64页 |
| ·乳腺上皮细胞添加LPS代数的选取 | 第64页 |
| ·提取乳腺上皮细胞总RNA | 第64-65页 |
| ·反转录(RT)与荧光定量(RT-PCR)反应 | 第65页 |
| ·基因表达定量方法 | 第65页 |
| ·数据统计分析方法 | 第65页 |
| ·结果 | 第65-73页 |
| ·乳腺上皮细胞不同代(传1-8代)α-酪蛋白表达结果 | 第65-66页 |
| ·RT-qPCR的扩增、熔解曲线与扩增效率曲线 | 第66页 |
| ·添加不同浓度LPS后不同时间β-防御素表达量的变化 | 第66-73页 |
| ·讨论 | 第73-76页 |
| ·乳腺上皮细胞的代数选择 | 第73-74页 |
| ·6种β-防御素的表达变化 | 第74-75页 |
| ·6种β-防御素的表达类型 | 第75页 |
| ·α-酪蛋白的表达变化 | 第75-76页 |
| ·小结 | 第76-77页 |
| 6 试验五 乳腺上皮细胞通过LPS刺激后可能通路的表达变化研究 | 第77-95页 |
| ·试验材料与试剂 | 第77-78页 |
| ·材料 | 第77页 |
| ·仪器和试剂 | 第77页 |
| ·通路基因RT-PCR引物设计与合成 | 第77-78页 |
| ·试验方法 | 第78-82页 |
| ·乳腺上皮细胞培养 | 第78页 |
| ·提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA | 第78页 |
| ·RT反应 | 第78-79页 |
| ·PCR扩增 | 第79页 |
| ·克隆基因及筛选重组质粒 | 第79页 |
| ·RT-PCR产物的回收 | 第79页 |
| ·连接反应 | 第79-80页 |
| ·连接产物转化 | 第80页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第80-81页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第81页 |
| ·PCR产物克隆的序列测定 | 第81页 |
| ·RT-qPCR反应 | 第81-82页 |
| ·结果 | 第82-89页 |
| ·乳腺上皮细胞总RNA的检测结果 | 第82页 |
| ·乳腺组织RT-PCR扩增结果 | 第82-83页 |
| ·基因测序与同源性比较 | 第83页 |
| ·RT-qPCR产物的扩增、熔解曲线及扩增效率曲线 | 第83-85页 |
| ·相对表达变化结果 | 第85-89页 |
| ·讨论 | 第89-94页 |
| ·可能信号通路基因的通路相关研究 | 第89-91页 |
| ·几个调控基因的克隆与细胞代数的选取 | 第91-92页 |
| ·关于NF-κB P65的变化 | 第92页 |
| ·关于CREB的表达变化 | 第92-93页 |
| ·关于TLRs的表达变化 | 第93-94页 |
| ·小结 | 第94-95页 |
| 7 试验六 阻断NF-κ B对乳腺上皮细胞防御素表达的影响 | 第95-104页 |
| ·试验材料与试剂 | 第95-96页 |
| ·材料 | 第95页 |
| ·仪器和试剂 | 第95页 |
| ·通路基因RT-PCR引物设计与合成 | 第95-96页 |
| ·试验方法 | 第96-98页 |
| ·乳腺上皮细胞培养 | 第96-97页 |
| ·提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA | 第97页 |
| ·荧光定量RT-PCR反应 | 第97-98页 |
| ·数据统计分析方法 | 第98页 |
| ·结果 | 第98-103页 |
| ·BNBD5 mRNA表达的影响 | 第98页 |
| ·BNBD7 mRNA表达变化 | 第98-99页 |
| ·TAP mRNA表达变化 | 第99页 |
| ·LAP mRNA表达变化 | 第99-100页 |
| ·EBD mRNA表达变化 | 第100-101页 |
| ·BNBD4 mRNA表达 | 第101页 |
| ·TLR2 mRNA表达变化 | 第101-102页 |
| ·TLR4 mRNA表达变化 | 第102页 |
| ·CREB mRNA表达变化 | 第102-103页 |
| ·讨论 | 第103页 |
| ·小结 | 第103-104页 |
| 8 结论 | 第104-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-124页 |
| 附录 | 第124-130页 |
| 作者简介 | 第130页 |
