枳CBF1类似基因PtCBF1启动子的克隆与功能分析
| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略词 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-32页 |
| 1 柑橘抗寒研究的意义 | 第13页 |
| 2 柑橘抗寒研究的现状 | 第13-19页 |
| ·细胞膜与柑橘抗寒 | 第13-14页 |
| ·细胞抗氧化途径与柑橘抗寒 | 第14-15页 |
| ·细胞的渗透调节物与柑橘抗寒 | 第15-17页 |
| ·植物生长物质与柑橘抗寒 | 第17页 |
| ·植物细胞应答低温的基因与柑橘抗寒 | 第17-19页 |
| 3 冷胁迫应答基因的调节网络 | 第19-26页 |
| ·依赖ABA的低温应答途径 | 第19-21页 |
| ·AREB/ABF-ABRE途径 | 第19-21页 |
| ·其他类型的ABA依赖的基因表达途径 | 第21页 |
| ·非ABA依赖的低温应答途径 | 第21-26页 |
| ·CBF途径 | 第21-24页 |
| ·ICE1途径 | 第24页 |
| ·其他调节CBF表达的途径 | 第24-25页 |
| ·参与冷驯化的非CBF冷调节途径 | 第25页 |
| ·春化作用途径 | 第25-26页 |
| 4 果树抗逆性基因工程研究进展 | 第26页 |
| 5 植物启动子研究 | 第26-30页 |
| ·植物启动子的基本结构及功能 | 第26-27页 |
| ·启动子的类型 | 第27-30页 |
| ·组成型启动子 | 第27-28页 |
| ·组织特异型启动子 | 第28-29页 |
| ·诱导型启动子 | 第29-30页 |
| 6 本研究的目的意义 | 第30-32页 |
| 第二章 PtCBF1上游序列的分离 | 第32-52页 |
| 1 前言 | 第32页 |
| 2 材料与试剂 | 第32-33页 |
| ·材料 | 第32-33页 |
| ·实验试剂 | 第33页 |
| 3 实验方法 | 第33-42页 |
| ·基因组DNA的提取及检测 | 第33-34页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第33-34页 |
| ·基因组DNA的检测 | 第34页 |
| ·PtCBF1编码区DNA区PCR扩增 | 第34-35页 |
| ·PCR产物的检测及回收 | 第35页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测 | 第35页 |
| ·回收纯化目标片断 | 第35页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌的转化及阳性克隆的增殖 | 第36-37页 |
| ·CaCl_2法制备感受态细胞 | 第36页 |
| ·转化 | 第36-37页 |
| ·阳性克隆的增值 | 第37页 |
| ·检测阳性克隆 | 第37-38页 |
| ·质粒DNA的提取(碱裂解法) | 第37-38页 |
| ·阳性检测 | 第38页 |
| ·TAIL-PCR扩增启动子序列 | 第38-41页 |
| ·SON-PCR克隆PtCBF1启动子序列 | 第41-42页 |
| ·PCR验证所克隆的启动子序列 | 第42页 |
| ·生物信息学分析 | 第42页 |
| 4 结果与分析 | 第42-49页 |
| ·PtCBF1编码区DNA克隆 | 第42-43页 |
| ·TAIL-PCR扩增启动子序列 | 第43-44页 |
| ·利用SON-PCR进行第二轮染色体步行 | 第44-45页 |
| ·PCR验证所克隆的启动子序列 | 第45-46页 |
| ·生物信息学分析所克隆的启动子序列 | 第46-49页 |
| ·比对与TSS预测 | 第46页 |
| ·顺式元件预测 | 第46-49页 |
| 5 讨论 | 第49-52页 |
| 第三章 PtCBF1启动子功能的验证及分析 | 第52-67页 |
| 1 前言 | 第52页 |
| 2 材料与试剂 | 第52-53页 |
| ·实验材料 | 第52-53页 |
| ·实验试剂 | 第53页 |
| 3 实验方法 | 第53-60页 |
| ·表达载体构建 | 第53-55页 |
| ·引物设计及PCR | 第53-54页 |
| ·TA克隆及正反向插入的检测 | 第54页 |
| ·酶切、连接 | 第54-55页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第55页 |
| ·构建载体的检测 | 第55页 |
| ·基因枪介导法转化洋葱表皮 | 第55-56页 |
| ·洋葱表皮细胞的培养 | 第55页 |
| ·金粉准备 | 第55页 |
| ·微弹制备 | 第55页 |
| ·基因枪的准备 | 第55-56页 |
| ·基因枪的轰击 | 第56页 |
| ·洋葱表皮培养及观察 | 第56页 |
| ·根癌农杆菌感受态细胞制备 | 第56页 |
| ·工程菌的制备 | 第56-57页 |
| ·转化农杆菌 | 第56页 |
| ·菌落阳性检测及工程菌保存 | 第56-57页 |
| ·Floral Dip法转化拟南芥 | 第57页 |
| ·植物材料准备 | 第57页 |
| ·农杆菌准备 | 第57页 |
| ·拟南芥的转化 | 第57页 |
| ·转化植株的筛选 | 第57页 |
| ·农杆菌介导法转化枳上胚轴 | 第57-60页 |
| ·枳无菌繁殖 | 第57-58页 |
| ·外植体预培养 | 第58页 |
| ·农杆菌培养 | 第58页 |
| ·浸染 | 第58页 |
| ·共培养 | 第58页 |
| ·选择培养 | 第58页 |
| ·继代选择培养 | 第58页 |
| ·生根培养 | 第58页 |
| ·嫁接培养 | 第58-59页 |
| ·炼苗移栽 | 第59页 |
| ·PCR检测及荧光检测 | 第59页 |
| ·实验所用的组织培养基 | 第59-60页 |
| 4 结果与分析 | 第60-64页 |
| ·表达载体构建 | 第60-61页 |
| ·基因枪介导法转化洋葱表皮 | 第61-62页 |
| ·Floral Dip法转化拟南芥 | 第62页 |
| ·根癌农杆菌介导法转化枳上胚轴 | 第62-64页 |
| ·枳上胚轴转基因植株的再生 | 第62-63页 |
| ·转基因植株的PCR及GFP荧光检测 | 第63-64页 |
| ·启动子的诱导性分析及缺失分析 | 第64页 |
| 5 讨论 | 第64-67页 |
| ·启动子活性分析 | 第64页 |
| ·启动子功能区的定位 | 第64-65页 |
| ·转化枳上胚轴再生苗的一些问题讨论 | 第65-66页 |
| ·使用报告基因GFP的一些讨论 | 第66-67页 |
| 第四章 总结与展望 | 第67-68页 |
| 1 本研究的成果与不足 | 第67页 |
| 2 进一步可展开的工作 | 第67-68页 |
| 参考文献: | 第68-82页 |
| 图版和图版说明 | 第82-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 在读期间发表的文章 | 第87页 |
