| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-10页 |
| 第一章 综述 | 第10-21页 |
| 1、抗菌肽 | 第10-13页 |
| ·抗菌肽的分类 | 第10-11页 |
| ·抗菌肽的生物活性 | 第11-12页 |
| ·抗菌肽的抗细菌作用机理 | 第12-13页 |
| ·存在的问题及前景 | 第13页 |
| 2 抗菌肽DCD-1L | 第13-14页 |
| 3 抗菌肽基因的克隆表达策略 | 第14-16页 |
| ·人工合成抗菌肽编码基因 | 第14-15页 |
| ·密码子优化 | 第15页 |
| ·融合表达策略 | 第15-16页 |
| ·基因的多拷贝同向串联 | 第16页 |
| 4. 毕赤酵母表达系统 | 第16-21页 |
| 第二章 抗菌肽DCD-1L基因在毕赤酵母G5115 中的表达 | 第21-45页 |
| 1 前言 | 第21页 |
| 2 试剂及仪器 | 第21-23页 |
| ·菌株及质粒 | 第21页 |
| ·基因片段及引物 | 第21页 |
| ·试剂及工具酶 | 第21-22页 |
| ·仪器设备 | 第22-23页 |
| 3、方法 | 第23-35页 |
| ·抗菌肽DCD-1L基因的合成、扩增[1] 及纯化 | 第23-26页 |
| ·质粒载体pPICZα-A的制备 | 第26-27页 |
| ·抗菌肽DCD-1L表达载体的构建 | 第27-31页 |
| ·抗菌肽DCD-1L在Pichia pastoris G5115 中的表达 | 第31-35页 |
| 4 结果与分析 | 第35-41页 |
| ·重叠延伸PCR法获得DCD-1L的基因 | 第35-36页 |
| ·质粒pPICZα-A的抽提 | 第36页 |
| ·DCD-1L基因的双酶切 | 第36-37页 |
| ·质粒pPICZα-A双酶切 | 第37页 |
| ·连接检测 | 第37-38页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌DH5α | 第38页 |
| ·阳性克隆的菌落PCR鉴定 | 第38-39页 |
| ·重组质粒pPICZα-DCD-1L的线性化 | 第39页 |
| ·重组质粒电转化Pichia pastoris G5115 | 第39-40页 |
| ·PCR鉴定重组Pichia pastoris G5115 阳性克隆 | 第40页 |
| ·表达产物的抑菌圈实验 | 第40-41页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳 | 第41页 |
| 5 讨论 | 第41-45页 |
| ·关于抗菌肽DCD-1L | 第41-42页 |
| ·关于PCR产物酶切保护碱基的设计 | 第42-43页 |
| ·关于线性化的原因 | 第43页 |
| ·关于多肽的分泌表达 | 第43-45页 |
| 第三章 DCD-1L随机突变文库及其表达载体的构建和高效表达菌株筛选方法初探 | 第45-59页 |
| 1 前言 | 第45页 |
| 2 试剂及仪器 | 第45-46页 |
| ·菌株及质粒 | 第45页 |
| ·基因片段及引物 | 第45页 |
| ·试剂及工具酶 | 第45-46页 |
| ·仪器设备 | 第46页 |
| 3、方法 | 第46-53页 |
| ·抗菌肽DCD-1L基因随机突变体的制备 | 第46-49页 |
| ·质粒载体pGAPZα-C的制备 | 第49-50页 |
| ·DCD-1L突变体及质粒pGAPZα-C的双酶切及纯化 | 第50页 |
| ·DCD-1L突变体和质粒pGAPZα-C的连接 | 第50-51页 |
| ·突变文库表达载体的构建 | 第51-52页 |
| ·DCD-1L基因随机突变库的真核转化及活性菌株筛选 | 第52-53页 |
| 4 结果与分析 | 第53-57页 |
| ·重叠延伸PCR法获得DCD-1L的基因 | 第53页 |
| ·易错PCR | 第53-54页 |
| ·DCD-1L突变体的双酶切 | 第54-55页 |
| ·质粒pGAPZα-C双酶切 | 第55页 |
| ·连接检测 | 第55-56页 |
| ·Pichia pastoris SMD1168 的生长曲线 | 第56页 |
| ·电转化Pichia pastoris SMD1168 的参数优化 | 第56-57页 |
| ·高效抑菌活性菌株的筛选 | 第57页 |
| 5 讨论 | 第57-58页 |
| ·定向进化的策略 | 第57页 |
| ·关于质粒pGAPZα和Pichia pastoris SMD1168 的选择 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-59页 |
| 结论 | 第59-60页 |
| 附录1：主要溶液配制方法 | 第60-62页 |
| 附录2：质粒pPICZα系列图谱 | 第62-63页 |
| 附录3：质粒pPICZα-A多克隆位点 | 第63-64页 |
| 附录4：质粒pGAPZα系列图谱 | 第64-65页 |
| 附录5：质粒pGAPZα-C多克隆位点 | 第65-66页 |
| 附录6：重组质粒测序结果（5′AOX） | 第66-67页 |
| 重组质粒测序结果(3′AOX) | 第67-68页 |
| 硕士期间发表论文及参与课题 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
