| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第16-41页 |
| 1.1 手足口病概述 | 第16-18页 |
| 1.1.1 手足口病的简介 | 第16-17页 |
| 1.1.2 手足口病的传播与流行 | 第17页 |
| 1.1.3 手足口病的病原学特征 | 第17-18页 |
| 1.1.4 手足口病的预防与治疗 | 第18页 |
| 1.2 肠道病毒71型(EV71) | 第18-22页 |
| 1.2.1 肠道病毒71型简介 | 第18-19页 |
| 1.2.2 EV71基因组结构 | 第19-20页 |
| 1.2.3 EV71病毒颗粒结构 | 第20-21页 |
| 1.2.4 EV71的生活史 | 第21-22页 |
| 1.3 EV71 3C蛋白酶 | 第22-28页 |
| 1.3.1 3C蛋白酶简介 | 第22-26页 |
| 1.3.2 3C蛋白酶的作用 | 第26页 |
| 1.3.3 3C蛋白酶抑制剂的研究进展 | 第26-28页 |
| 1.4 柯萨奇病毒B3型(CVB3) | 第28-32页 |
| 1.4.1 柯萨奇病毒B3型简介 | 第28-30页 |
| 1.4.2 CVB3基因组和病毒颗粒结构 | 第30-31页 |
| 1.4.3 CVB3致病机理和研究进展 | 第31-32页 |
| 1.5. CVB3 3D聚合酶 | 第32-36页 |
| 1.5.1 3D聚合酶简介 | 第32-34页 |
| 1.5.2 3D聚合酶起始与延伸 | 第34-36页 |
| 1.5.3 CVB3 3D聚合酶抑制剂的研究进展 | 第36页 |
| 1.6 结构生物学概述 | 第36-37页 |
| 1.7 蛋白质的结晶 | 第37-38页 |
| 1.7.1 蛋白质的结晶方法 | 第37-38页 |
| 1.7.2 影响蛋白晶体的因素 | 第38页 |
| 1.8 基于片段的药物发现技术 | 第38-39页 |
| 1.9 课题的研究意义 | 第39-41页 |
| 1.9.1 EV71 3C蛋白酶药物研究的意义 | 第39-40页 |
| 1.9.2 CVB3 3D~(pol)药物研究的意义 | 第40-41页 |
| 2 材料与方法 | 第41-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第41-43页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第41页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第41-42页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第42-43页 |
| 2.2 常用试剂的配制 | 第43-48页 |
| 2.2.1 培养基及细菌培养相关溶液的配制 | 第43-45页 |
| 2.2.2 分子克隆相关试剂的配制 | 第45页 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳相关试剂的配制 | 第45页 |
| 2.2.4 SDS-PAGE相关溶液的配制 | 第45-47页 |
| 2.2.5 重组蛋白纯化相关试剂 | 第47-48页 |
| 2.2.5.1 EV71 3C蛋白酶纯化相关试剂 | 第47-48页 |
| 2.2.5.2 CVB3 3D~(pol)纯化相关试剂 | 第48页 |
| 2.3 实验方法 | 第48-58页 |
| 2.3.1 重组蛋白表达质粒的构建 | 第48-52页 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌超级感受态的制备 | 第48-49页 |
| 2.3.1.2 转化 | 第49页 |
| 2.3.1.3 目的基因的获取 | 第49页 |
| 2.3.1.4 引物设计 | 第49-50页 |
| 2.3.1.5 目的片段的扩增及回收 | 第50-51页 |
| 2.3.1.6 原核表达载体的制备 | 第51页 |
| 2.3.1.7 双酶切载体 | 第51页 |
| 2.3.1.8 目的片段与酶切载体连接 | 第51-52页 |
| 2.3.2 重组蛋白的表达 | 第52-53页 |
| 2.3.2.1 重组蛋白表达条件的摸索 | 第52-53页 |
| 2.3.2.2 目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测 | 第53页 |
| 2.3.2.3 重组蛋白的大量表达 | 第53页 |
| 2.3.3 EV71 3C蛋白酶的纯化 | 第53-55页 |
| 2.3.3.1 Ni-NTA亲和柱层析 | 第53-54页 |
| 2.3.3.2 脱盐柱置换缓冲液 | 第54-55页 |
| 2.3.3.3 离子交换柱层析 | 第55页 |
| 2.3.4 CVB3 3D聚合酶的纯化 | 第55-56页 |
| 2.3.4.1 Ni-NTA亲和柱层析 | 第55页 |
| 2.3.4.2 凝胶过滤柱层析 | 第55-56页 |
| 2.3.5 重组蛋白的结晶 | 第56-58页 |
| 2.3.5.1 结晶条件的初筛 | 第56页 |
| 2.3.5.2 结晶条件的优化 | 第56页 |
| 2.3.5.3 获得复合物晶体 | 第56-57页 |
| 2.3.5.4 衍射数据的收集和处理 | 第57页 |
| 2.3.5.5 结构解析 | 第57-58页 |
| 3 结果分析与讨论 | 第58-80页 |
| 3.1 EV713C蛋白酶的药物筛选 | 第58-68页 |
| 3.1.1 EV71 3C蛋白酶的表达与纯化 | 第58-60页 |
| 3.1.2 3C蛋白酶的结晶 | 第60-62页 |
| 3.1.3 3C蛋白酶与小分子晶体复合物的获得 | 第62-63页 |
| 3.1.4 衍射数据的收集和结构解析 | 第63-65页 |
| 3.1.5 3C蛋白酶晶体与小分子复合物的结构 | 第65-67页 |
| 3.1.6 讨论与总结 | 第67-68页 |
| 3.2 柯萨奇病毒B3型3D~(pol)的结构生物学研究 | 第68-80页 |
| 3.2.1 CVB3 3Dpol的表达与纯化 | 第68-74页 |
| 3.2.2 CVB3 3Dpol的结晶 | 第74-76页 |
| 3.2.3 衍射数据的收集和结构解析 | 第76-78页 |
| 3.2.4 讨论与总结 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-90页 |
| 致谢 | 第90页 |
