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检测H5禽流感RT-LAMP方法的建立及其在鸭鹅核酸样品分子流行病学调查中的应用

摘要第4-5页
ABSTRACT第5-6页
第一章 文献综述第10-27页
    1. 禽流感病毒的研究现状第10-17页
        1.1 禽流感病毒的流行病学第10-11页
        1.2 禽流感病毒的理化特性第11-12页
        1.3 禽流感病毒分子生物学第12-15页
        1.4 禽流感病毒的复制感染模式第15-16页
        1.5 禽流感病毒的遗传与进化第16-17页
    2. 禽流感诊断方法的研究进展第17-26页
        2.1 血清诊断方法第17-18页
            2.1.1 病毒的分离(Virus Isolation)第17页
            2.1.2 琼脂凝胶扩散试验(AGP)第17页
            2.1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)第17-18页
            2.1.4 血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)第18页
        2.2 分子生物学诊断方法第18-26页
            2.2.1 常规RT-PCR技术第18-19页
            2.2.2 依赖核酸扩增技术第19-21页
            2.2.3 环介导恒温扩增第21-22页
            2.2.4 定量PCR技术(Real-time PCR)第22-24页
            2.2.5 微列阵技术(microarry DNA)第24页
            2.2.6 焦凝酸测序技术(pyrosequencing)第24-26页
            2.2.7 糖芯片(Glyc chip)第26页
    3. 研究目的和意义第26-27页
第二章 H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速诊断方法的建立及其临床应用第27-47页
    1. 材料第27-29页
        1.1 毒株、菌株及载体的来源第27页
        1.2 临床样本来源第27页
        1.3 主要仪器第27页
        1.4 主要生物试剂第27-28页
        1.5 试验试剂的配制第28-29页
    2. 试验方法第29-38页
        2.1 RT-LAMP引物和RT-PCR引物设计第29-30页
        2.2 总RNA和DNA的抽提及cDNA的合成第30-31页
            2.2.1 总RNA的抽提第30页
            2.2.2 1~(st)strand-cDNA的合成:第30-31页
            2.2.3 总DNA的抽提第31页
        2.3 HA基因的体外转录第31-36页
            2.3.1 pJet-HA质粒的构建第32-34页
            2.3.2 pJet-HA重组质粒的鉴定第34-35页
            2.3.3 pJet-HA载体线性化酶切第35页
            2.3.4 HA基因体外转录反应及拷贝数分析第35-36页
        2.4 H5-RT-LAMP引物可行性确认第36页
        2.5 H5-RT-LAMP反应引物比例优化第36-37页
        2.6 H5-RT-LAMP扩增反应条件优化第37页
            2.6.1 LAMP反应时间的优化第37页
            2.6.2 LAMP反应Tm值优化第37页
        2.7 H5-RT-LAMP扩增反应与WHO RT-PCR灵敏度比较第37-38页
        2.8 H5-RT-LAMP扩增反应特异性检测第38页
        2.9 H5-RT-LAMP扩增方法可视化检测第38页
        2.10 H5-RT-LAMP检测方法临床运用第38页
    3. 结果第38-44页
        3.1 重组质粒pJet-HA的验证第38-39页
        3.2 H5-RT-LAMP引物可行性验证第39页
        3.3 H5-RT-LAMP反应引物比例优化第39-40页
        3.4 H5-RT-LAMP扩增反应时间优化第40-41页
        3.5 H5-RT-LAMP扩增反应Tm值优化第41页
        3.6 H5-RT-LAMP反应检测灵敏度比较第41-42页
        3.7 H5-RT-LAMP扩增反应特异性第42-43页
        3.8 H5-RT-LAMP扩增方法可视化检测结果第43-44页
        3.9 H5-RT-LAMP检测方法临床检测结果第44页
    4. 讨论第44-47页
第三章 H5亚型鸭鹅流感病毒的分子流行病学调查第47-59页
    1. 材料第47-49页
        1.1 临床样本来源第47页
        1.2 菌株与载体第47页
        1.3 主要试剂第47页
        1.4 主要仪器第47-48页
        1.5 试剂配制第48页
        1.6 生物信息学分析软件第48页
        1.7 序列分析参考毒株来源及宿主第48页
        1.8 其他第48-49页
    2. 方法第49-54页
        2.1 咽喉、肛门拭子与肺脏组织的处理第49页
        2.2 样本总RNA的抽提第49-50页
        2.3 样本cDNA的转录合成第50页
        2.4 H5亚型禽流感病毒的PCR检测第50-51页
        2.5 病毒RNA的抽提第51页
        2.6 病毒cDNA的合成第51-52页
        2.7 HA全基因的扩增第52页
        2.8 HA基因的克隆及测序第52-53页
            2.8.1 HA基因扩增片段的胶回收及纯化第52页
            2.8.2 HA基因的连接第52页
            2.8.3 PMD-18-HA连接质粒的转化第52-53页
            2.8.4 PMD-18-HA重组质粒的抽提及PCR鉴定第53页
            2.8.5 PMD-18-HA质粒的测序第53页
        2.9 HA基因序列的编辑整理及分析第53-54页
    3. 结果第54-57页
        3.1 临床样本检测结果第54页
        3.2 HA基因氨基酸序列的翻译及生物信息学分析第54-57页
            3.2.1 HA基因氨基酸受体位点的分析第54页
            3.2.2 HA基因氨基酸裂解位点的分析第54-55页
            3.2.3 HA基因糖基化位点的预测分析第55页
            3.2.4 HA基因氨基酸相似性的比对分析第55-56页
            3.2.5 分离毒株与参考毒株的亲缘关系分析及进化树的构建第56-57页
    4. 讨论第57-59页
第四章 结论第59-60页
参考文献第60-64页
致谢第64页

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