摘要 | 第4-5页 |
ABSTRACT | 第5-6页 |
第一章 文献综述 | 第10-27页 |
1. 禽流感病毒的研究现状 | 第10-17页 |
1.1 禽流感病毒的流行病学 | 第10-11页 |
1.2 禽流感病毒的理化特性 | 第11-12页 |
1.3 禽流感病毒分子生物学 | 第12-15页 |
1.4 禽流感病毒的复制感染模式 | 第15-16页 |
1.5 禽流感病毒的遗传与进化 | 第16-17页 |
2. 禽流感诊断方法的研究进展 | 第17-26页 |
2.1 血清诊断方法 | 第17-18页 |
2.1.1 病毒的分离(Virus Isolation) | 第17页 |
2.1.2 琼脂凝胶扩散试验(AGP) | 第17页 |
2.1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第17-18页 |
2.1.4 血凝(HA)和血凝抑制试验(HI) | 第18页 |
2.2 分子生物学诊断方法 | 第18-26页 |
2.2.1 常规RT-PCR技术 | 第18-19页 |
2.2.2 依赖核酸扩增技术 | 第19-21页 |
2.2.3 环介导恒温扩增 | 第21-22页 |
2.2.4 定量PCR技术(Real-time PCR) | 第22-24页 |
2.2.5 微列阵技术(microarry DNA) | 第24页 |
2.2.6 焦凝酸测序技术(pyrosequencing) | 第24-26页 |
2.2.7 糖芯片(Glyc chip) | 第26页 |
3. 研究目的和意义 | 第26-27页 |
第二章 H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速诊断方法的建立及其临床应用 | 第27-47页 |
1. 材料 | 第27-29页 |
1.1 毒株、菌株及载体的来源 | 第27页 |
1.2 临床样本来源 | 第27页 |
1.3 主要仪器 | 第27页 |
1.4 主要生物试剂 | 第27-28页 |
1.5 试验试剂的配制 | 第28-29页 |
2. 试验方法 | 第29-38页 |
2.1 RT-LAMP引物和RT-PCR引物设计 | 第29-30页 |
2.2 总RNA和DNA的抽提及cDNA的合成 | 第30-31页 |
2.2.1 总RNA的抽提 | 第30页 |
2.2.2 1~(st)strand-cDNA的合成: | 第30-31页 |
2.2.3 总DNA的抽提 | 第31页 |
2.3 HA基因的体外转录 | 第31-36页 |
2.3.1 pJet-HA质粒的构建 | 第32-34页 |
2.3.2 pJet-HA重组质粒的鉴定 | 第34-35页 |
2.3.3 pJet-HA载体线性化酶切 | 第35页 |
2.3.4 HA基因体外转录反应及拷贝数分析 | 第35-36页 |
2.4 H5-RT-LAMP引物可行性确认 | 第36页 |
2.5 H5-RT-LAMP反应引物比例优化 | 第36-37页 |
2.6 H5-RT-LAMP扩增反应条件优化 | 第37页 |
2.6.1 LAMP反应时间的优化 | 第37页 |
2.6.2 LAMP反应Tm值优化 | 第37页 |
2.7 H5-RT-LAMP扩增反应与WHO RT-PCR灵敏度比较 | 第37-38页 |
2.8 H5-RT-LAMP扩增反应特异性检测 | 第38页 |
2.9 H5-RT-LAMP扩增方法可视化检测 | 第38页 |
2.10 H5-RT-LAMP检测方法临床运用 | 第38页 |
3. 结果 | 第38-44页 |
3.1 重组质粒pJet-HA的验证 | 第38-39页 |
3.2 H5-RT-LAMP引物可行性验证 | 第39页 |
3.3 H5-RT-LAMP反应引物比例优化 | 第39-40页 |
3.4 H5-RT-LAMP扩增反应时间优化 | 第40-41页 |
3.5 H5-RT-LAMP扩增反应Tm值优化 | 第41页 |
3.6 H5-RT-LAMP反应检测灵敏度比较 | 第41-42页 |
3.7 H5-RT-LAMP扩增反应特异性 | 第42-43页 |
3.8 H5-RT-LAMP扩增方法可视化检测结果 | 第43-44页 |
3.9 H5-RT-LAMP检测方法临床检测结果 | 第44页 |
4. 讨论 | 第44-47页 |
第三章 H5亚型鸭鹅流感病毒的分子流行病学调查 | 第47-59页 |
1. 材料 | 第47-49页 |
1.1 临床样本来源 | 第47页 |
1.2 菌株与载体 | 第47页 |
1.3 主要试剂 | 第47页 |
1.4 主要仪器 | 第47-48页 |
1.5 试剂配制 | 第48页 |
1.6 生物信息学分析软件 | 第48页 |
1.7 序列分析参考毒株来源及宿主 | 第48页 |
1.8 其他 | 第48-49页 |
2. 方法 | 第49-54页 |
2.1 咽喉、肛门拭子与肺脏组织的处理 | 第49页 |
2.2 样本总RNA的抽提 | 第49-50页 |
2.3 样本cDNA的转录合成 | 第50页 |
2.4 H5亚型禽流感病毒的PCR检测 | 第50-51页 |
2.5 病毒RNA的抽提 | 第51页 |
2.6 病毒cDNA的合成 | 第51-52页 |
2.7 HA全基因的扩增 | 第52页 |
2.8 HA基因的克隆及测序 | 第52-53页 |
2.8.1 HA基因扩增片段的胶回收及纯化 | 第52页 |
2.8.2 HA基因的连接 | 第52页 |
2.8.3 PMD-18-HA连接质粒的转化 | 第52-53页 |
2.8.4 PMD-18-HA重组质粒的抽提及PCR鉴定 | 第53页 |
2.8.5 PMD-18-HA质粒的测序 | 第53页 |
2.9 HA基因序列的编辑整理及分析 | 第53-54页 |
3. 结果 | 第54-57页 |
3.1 临床样本检测结果 | 第54页 |
3.2 HA基因氨基酸序列的翻译及生物信息学分析 | 第54-57页 |
3.2.1 HA基因氨基酸受体位点的分析 | 第54页 |
3.2.2 HA基因氨基酸裂解位点的分析 | 第54-55页 |
3.2.3 HA基因糖基化位点的预测分析 | 第55页 |
3.2.4 HA基因氨基酸相似性的比对分析 | 第55-56页 |
3.2.5 分离毒株与参考毒株的亲缘关系分析及进化树的构建 | 第56-57页 |
4. 讨论 | 第57-59页 |
第四章 结论 | 第59-60页 |
参考文献 | 第60-64页 |
致谢 | 第64页 |