| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-13页 |
| 缩略词表 | 第17-18页 |
| 第一章 基因编辑技术研究进展 | 第18-29页 |
| 1 基因编辑技术的发展 | 第18-25页 |
| 1.1 限制性内切酶 | 第18页 |
| 1.2 同源重组与基因打靶 | 第18-20页 |
| 1.3 锌指核酸酶(ZFN) | 第20-21页 |
| 1.4 转录激活样效应蛋白质核酸酶(TALEN) | 第21-22页 |
| 1.5 RNA介导的DNA编辑(CRISPR-Cas9) | 第22-24页 |
| 1.6 DNA介导的DNA编辑(ssDNA-Ago) | 第24-25页 |
| 2 基因编辑新技术的比较 | 第25-26页 |
| 3 基因编辑技术的应用前景 | 第26-28页 |
| 3.1 用于基因功能的研究 | 第26页 |
| 3.2 用于基因治疗研究 | 第26-27页 |
| 3.3 用于制备模式动物 | 第27页 |
| 3.4 用于生物新品种的培育 | 第27-28页 |
| 4 展望 | 第28-29页 |
| 第二章 阿尔巴斯白绒山羊EDAR基因打靶sgRNA的制备 | 第29-40页 |
| 引言 | 第29-30页 |
| 1 实验材料 | 第30-31页 |
| 1.1 实验仪器设备 | 第30页 |
| 1.2 菌种与载体 | 第30-31页 |
| 1.3 主要实验材料、试剂与耗材 | 第31页 |
| 2 实验方法 | 第31-35页 |
| 2.1 sgRNA的设计 | 第31页 |
| 2.2 sgRNA的表达载体的构建 | 第31-32页 |
| 2.3 电穿孔法转染绒山羊胎儿成纤维细胞 | 第32-33页 |
| 2.4 sgRNA的活性检测 | 第33-35页 |
| 3 实验结果 | 第35-38页 |
| 3.1 sgRNA的设计 | 第35-36页 |
| 3.2 sgRNA的质粒构建 | 第36页 |
| 3.3 sgRNA的打靶活性检测 | 第36-38页 |
| 4 讨论 | 第38-40页 |
| 第三章 EDAR基因打靶阳性细胞的筛选 | 第40-50页 |
| 引言 | 第40-41页 |
| 1 实验材料 | 第41-42页 |
| 1.1 实验仪器设备 | 第41页 |
| 1.2 载体 | 第41页 |
| 1.3 主要实验材料、试剂与耗材 | 第41-42页 |
| 2 实验方法 | 第42-45页 |
| 2.1 阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞的分离和培养 | 第42页 |
| 2.2 电穿孔法转染绒山羊胎儿成纤维细胞 | 第42-43页 |
| 2.3 EDAR基因打靶单克隆细胞系的筛选 | 第43页 |
| 2.3.1 口吸管法 | 第43页 |
| 2.3.2 流式细胞仪分选法 | 第43页 |
| 2.3.3 稀释法 | 第43页 |
| 2.4 单克隆细胞系基因组的提取 | 第43-44页 |
| 2.5 EDAR基因打靶单克隆细胞系的鉴定 | 第44-45页 |
| 3 实验结果 | 第45-48页 |
| 3.1 山羊胎儿成纤维细胞的分离和培养 | 第45页 |
| 3.2 EDAR基因打靶单克隆细胞系的筛选 | 第45-46页 |
| 3.3 EDAR基因打靶单克隆细胞系的鉴定 | 第46-48页 |
| 4 讨论 | 第48-50页 |
| 第四章 利用体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊 | 第50-67页 |
| 引言 | 第50页 |
| 1 实验材料 | 第50-52页 |
| 1.1 实验仪器设备 | 第50-51页 |
| 1.2 主要实验材料、试剂与耗材 | 第51页 |
| 1.3 实验所需溶液的配制 | 第51-52页 |
| 2 实验方法 | 第52-57页 |
| 2.1 卵丘-卵母细胞复合体的采集及卵母细胞的体外成熟培养 | 第52页 |
| 2.2 EDAR基因打靶细胞的准备 | 第52页 |
| 2.3 体细胞核移植 | 第52页 |
| 2.4 卵母细胞-供体细胞复合体的电融合 | 第52-53页 |
| 2.5 重构胚的激活与发育 | 第53页 |
| 2.6 受体羊的处理与胚胎移植 | 第53页 |
| 2.7 检测EDAR基因打靶绒山羊皮肤样本中EDAR蛋白质的表达 | 第53-54页 |
| 2.8 EDAR基因打靶绒山羊不同部位皮肤样本石蜡切片的制作 | 第54页 |
| 2.9 脱靶分析 | 第54-57页 |
| 3 结果 | 第57-64页 |
| 3.1 EDAR基因打靶绒山羊克隆胚胎的发育 | 第57-59页 |
| 3.2 EDAR基因打靶绒山羊克隆胚胎移植及产羔 | 第59-62页 |
| 3.3 EDAR基因打靶绒山羊羔羊皮肤组织中EDAR蛋白质的表达 | 第62页 |
| 3.4 EDAR基因打靶绒山羊羔羊皮肤组织切片 | 第62-64页 |
| 3.5 脱靶分析 | 第64页 |
| 4 讨论 | 第64-67页 |
| 第五章 EDAR基因打靶绒山羊与野生型绒山羊皮肤基因差异表达分析 | 第67-94页 |
| 引言 | 第67-68页 |
| 1 实验材料 | 第68页 |
| 1.1 实验仪器设备 | 第68页 |
| 1.2 主要实验材料、试剂与耗材 | 第68页 |
| 1.3 主要使用软件与数据库 | 第68页 |
| 2 实验方法 | 第68-74页 |
| 2.1 实验材料的收集 | 第68-69页 |
| 2.2 实验皮肤样本RNA的提取 | 第69页 |
| 2.3 RNA-Seq文库的构建 | 第69页 |
| 2.4 Illumina/Solexa高通量测序 | 第69页 |
| 2.5 测序数据过滤 | 第69-70页 |
| 2.6 测序数据质量分布 | 第70页 |
| 2.7 测序数据碱基分布 | 第70-71页 |
| 2.8 比对率分析 | 第71-72页 |
| 2.9 基因区域分布 | 第72页 |
| 2.10 均一性分析 | 第72页 |
| 2.11 基因表达量估计 | 第72-73页 |
| 2.12 基因表达差异分析 | 第73页 |
| 2.13 差异表达基因GO功能分析 | 第73-74页 |
| 2.14 差异表达基因KEGG通路分析 | 第74页 |
| 3 结果 | 第74-92页 |
| 3.1 实验皮肤样本RNA的提取 | 第74-76页 |
| 3.2 数据过滤 | 第76页 |
| 3.3 测序质量分布 | 第76-77页 |
| 3.4 测序碱基分布 | 第77-78页 |
| 3.5 比对率分析 | 第78-79页 |
| 3.6 基因区域分布 | 第79-80页 |
| 3.7 均一性分析 | 第80-81页 |
| 3.8 基因表达量估计 | 第81-83页 |
| 3.9 基因表达差异分析 | 第83-87页 |
| 3.10 GO功能分析 | 第87-89页 |
| 3.11 KEGG通路分析 | 第89-92页 |
| 4 讨论 | 第92-94页 |
| 结论 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及发明专利 | 第109-110页 |
| 1 学术论文 | 第109-110页 |
| 2 发明专利 | 第110页 |
