| 摘要 | 第10-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 符号与缩略语说明 | 第17-19页 |
| 前言 | 第19-20页 |
| 第一部分 文献综述 | 第20-60页 |
| 第一章 百菌清及其在环境中的代谢转化 | 第20-26页 |
| 1 百菌清的主要物化性质及用途 | 第20-21页 |
| 2 百菌清的作用机制 | 第21页 |
| 3 百菌清的残留 | 第21-22页 |
| 4 百菌清的生态毒理 | 第22-23页 |
| 5 百菌清在环境中的代谢转化 | 第23-26页 |
| 5.1 百菌清的光学降解 | 第23-24页 |
| 5.2 百菌清的水解 | 第24页 |
| 5.3 百菌清在土壤中的降解 | 第24-26页 |
| 第二章 微生物对卤代化合物的脱卤作用 | 第26-50页 |
| 第一节 微生物脱卤作用 | 第26-32页 |
| 1 微生物对卤代化合物的利用情况 | 第26-30页 |
| 1.1 利用卤代脂肪族化合物的好氧生长 | 第28-29页 |
| 1.2 利用卤代芳香族化合物的好氧生长 | 第29-30页 |
| 1.3 利用卤代化合物作为底物的厌氧生长:厌氧呼吸 | 第30页 |
| 2 脱卤酶基因的表达与调控 | 第30-31页 |
| 3 脱卤酶基因的获取及分布 | 第31-32页 |
| 第二节 微生物脱卤作用方式 | 第32-39页 |
| 2.1 水解脱卤作用 | 第32-34页 |
| 2.2 硫醇取代脱卤 | 第34页 |
| 2.3 分子内取代 | 第34-35页 |
| 2.4 脱卤化氢作用 | 第35-36页 |
| 2.5 通过水合作用脱卤 | 第36页 |
| 2.6 甲基转移脱卤作用 | 第36页 |
| 2.7 氧化脱卤作用 | 第36-37页 |
| 2.8 还原脱卤作用 | 第37-39页 |
| 第三节 常见细菌脱卤酶的结构与催化机制 | 第39-48页 |
| 3.1 卤代烷烃脱卤酶 | 第39-41页 |
| 3.2 卤代烷酸脱卤酶 | 第41-42页 |
| 3.3 4-氯-苯甲酰-CoA脱卤酶 | 第42-43页 |
| 3.4 卤代醇脱卤酶 | 第43-45页 |
| 3.5 3-氯-丙烯酸脱卤酶 | 第45-48页 |
| 第四节 百菌清微生物降解研究存在的问题及发展方向 | 第48-50页 |
| 参考文献 | 第50-60页 |
| 第二部分 实验部分 | 第60-144页 |
| 第一章 百菌清降解菌株的分离与鉴定 | 第60-94页 |
| 第一节 百菌清降解菌株的分离与鉴定 | 第60-76页 |
| 1 材料与方法 | 第60-64页 |
| 1.1 菌株、培养基与试剂 | 第60-61页 |
| 1.2 百菌清降解菌株的分离筛选 | 第61页 |
| 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定 | 第61页 |
| 1.4 降解菌株的16S rRNA基因序列的分析 | 第61-63页 |
| 1.5 降解菌株系统发育地位的确定 | 第63页 |
| 1.6 降解菌株的ERIC-PCR指纹图谱分析 | 第63页 |
| 1.7 百菌清的测定 | 第63-64页 |
| 1.8 百菌清代谢产物羟基百菌清(TPN-OH)的测定 | 第64页 |
| 2 结果与分析 | 第64-76页 |
| 2.1 百菌清降解菌株的分离与筛选 | 第64-65页 |
| 2.2 降解菌株的菌落形态及生理生化特征 | 第65-68页 |
| 2.3 降解菌株的系统发育地位研究 | 第68-71页 |
| 2.4 同一属降解菌株的ERIC-PCR指纹图谱 | 第71页 |
| 2.5 菌株对百菌清的降解研究 | 第71-72页 |
| 2.6 菌株降解百菌清的代谢途径分析 | 第72-74页 |
| 2.7 菌株对土壤中百菌清的降解 | 第74-76页 |
| 第二节 百菌清降解菌株CTN-1分类学地位研究 | 第76-88页 |
| 1 材料与方法 | 第76-81页 |
| 1.1 培养基与菌株 | 第76页 |
| 1.2 菌株的鉴定 | 第76-80页 |
| 1.3 菌株对百菌清的降解 | 第80-81页 |
| 2 结果与分析 | 第81-88页 |
| 2.1 菌株初步鉴定 | 第81-82页 |
| 2.2 降解菌株的形态和培养特征 | 第82-85页 |
| 2.3 极性酯组份分析 | 第85页 |
| 2.4 醌组份分析 | 第85页 |
| 2.5 细胞壁脂肪酸成份分析 | 第85-86页 |
| 2.6 菌株总DNA G+C mol%的测定 | 第86页 |
| 2.7 DNA-DNA同源性分析 | 第86-88页 |
| 本章讨论 | 第88-89页 |
| 本章小结 | 第89-91页 |
| 参考文献 | 第91-94页 |
| 第二章 百菌清水解脱氯酶的基因克隆、表达与酶的催化机制初步研究 | 第94-144页 |
| 第一节 百菌清水解脱氯酶的基因(chd)克隆与表达 | 第95-109页 |
| 1 材料与方法 | 第95-100页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第95页 |
| 1.2 感受态细胞的制备 | 第95-97页 |
| 1.3 菌体总DNA的提取 | 第97页 |
| 1.4 质粒DNA的提取 | 第97页 |
| 1.5 染色体总DNA的Sau3AI酶切与片段回收 | 第97页 |
| 1.6 酶连 | 第97页 |
| 1.7 酶连产物的转化与阳性克隆的筛选 | 第97-98页 |
| 1.8 序列测定 | 第98页 |
| 1.9 基因序列比较与分析 | 第98页 |
| 1.10 阳性克隆子降解百菌清农药的检测 | 第98页 |
| 1.11 百菌清水解脱氯酶结构基因的PCR扩增 | 第98-99页 |
| 1.12 百菌清水解脱氯酶表达载体的构建 | 第99页 |
| 1.13 百菌清水解脱氯酶的SDS-PAGE分析 | 第99-100页 |
| 2 结果与分析 | 第100-109页 |
| 2.1 菌株CTN-3染色体总DNA的提取及Sau3AI部分酶切 | 第100-101页 |
| 2.2 菌株CTN-3总DNA文库的构建 | 第101页 |
| 2.3 阳性克隆子的筛选 | 第101-104页 |
| 2.4 基因序列测定及分析 | 第104-105页 |
| 2.5 结构基因的表达 | 第105-109页 |
| 第二节 百菌清水解脱氯酶(Chd)的功能验证 | 第109-115页 |
| 1 材料与方法 | 第110-112页 |
| 1.1 菌株、培养基与试剂 | 第110页 |
| 1.2 细菌生长量的测定 | 第110页 |
| 1.3 纯酶的制备 | 第110页 |
| 1.4 酶学反应条件与代谢产物提取 | 第110-111页 |
| 1.5 TLC展开剂配比的选择 | 第111页 |
| 1.6 硅胶薄层层析法收集代谢产物 | 第111页 |
| 1.7 代谢产物的鉴定 | 第111页 |
| 1.8 核磁共振实验 | 第111页 |
| 1.9 纯酶对百菌清厌氧脱氯 | 第111-112页 |
| 1.10 百菌清的分析方法 | 第112页 |
| 2 结果与分析 | 第112-115页 |
| 2.1 展开剂比例的选择 | 第112页 |
| 2.2 降解产物的初步推测 | 第112-114页 |
| 2.3 氯原子被取代位置的确定 | 第114-115页 |
| 2.4 厌氧脱氯 | 第115页 |
| 第三节 百菌清水解脱氯酶酶学特性的研究 | 第115-123页 |
| 1 实验材料与方法 | 第115-117页 |
| 1.1 材料 | 第115页 |
| 1.2 重组蛋白酶液的制备和纯化 | 第115-116页 |
| 1.3 百菌清水解脱氯酶的酶活力测定 | 第116页 |
| 1.4 酶的热稳定性与最适反应温度 | 第116页 |
| 1.5 酶的酸碱稳定性与最适反应pH值 | 第116页 |
| 1.6 金属离子对酶活性的影响 | 第116-117页 |
| 1.7 酶的动力学参数测定 | 第117页 |
| 1.8 酶对底物的特异性 | 第117页 |
| 1.9 酶的等电点测定 | 第117页 |
| 1.10 酶谱分析 | 第117页 |
| 1.11 酶在自然状态下分子量的测定 | 第117页 |
| 2 结果与分析 | 第117-123页 |
| 2.1 百菌清水解脱氯酶的反应进程曲线与酶浓度曲线 | 第118-119页 |
| 2.2 酶的热稳定性与最适反应温度 | 第119页 |
| 2.3 酶的酸碱稳定性与最适反应pH值 | 第119-120页 |
| 2.4 金属离子对酶活性的影响 | 第120-121页 |
| 2.5 酶的动力学参数与底物特异性研究 | 第121页 |
| 2.6 酶的等电点 | 第121页 |
| 2.7 酶谱分析及分子量和聚合状态 | 第121-123页 |
| 第四节 百菌清水解脱氯酶催化机理的初步探索 | 第123-132页 |
| 1 材料与方法 | 第124-126页 |
| 1.1 材料 | 第124页 |
| 1.2 表面活性剂和酶抑制剂对酶活性的影响 | 第124页 |
| 1.3 化学方法研究酶的活性位点 | 第124页 |
| 1.4 酶对金属离子的依赖性 | 第124-125页 |
| 1.5 定点突变引物设计 | 第125页 |
| 1.6 突变方法 | 第125页 |
| 1.7 PCR产物酶连转化 | 第125-126页 |
| 1.8 突变重组酶的纯化 | 第126页 |
| 1.9 突变重组酶酶活力检测 | 第126页 |
| 2 结果与分析 | 第126-132页 |
| 2.1 表面活性剂和酶抑制剂对酶活性的影响 | 第126页 |
| 2.2 金属离子依赖性 | 第126-127页 |
| 2.3 定点突变策略 | 第127页 |
| 2.4 单位点突变体酶的构建 | 第127-128页 |
| 2.5 定点突变对酶活力影响 | 第128-132页 |
| 本章讨论 | 第132-137页 |
| 本章小结 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-144页 |
| 全文总结 | 第144-148页 |
| 主要创新点 | 第148-150页 |
| 下一步工作设想 | 第150-152页 |
| 附录 | 第152-166页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 | 第166-168页 |
| 致谢 | 第168页 |
