| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 图表目录 | 第11-13页 |
| 缩略词 | 第13-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-37页 |
| 1.1 研究目的与意义 | 第15页 |
| 1.2 β-内酰胺类药物概述 | 第15-19页 |
| 1.2.1 结构与分类 | 第15-16页 |
| 1.2.2 理化性质 | 第16页 |
| 1.2.3 作用机制 | 第16页 |
| 1.2.4 牛乳中抗生素残留问题溯源 | 第16-17页 |
| 1.2.5 残留危害 | 第17-18页 |
| 1.2.6 世界各国对抗生素残留的监控管理 | 第18-19页 |
| 1.3 β-内酰胺类药物残留检测方法研究进展 | 第19-29页 |
| 1.3.1 仪器分析法 | 第19-20页 |
| 1.3.2 微生物检测法 | 第20-21页 |
| 1.3.3 免疫分析法 | 第21-23页 |
| 1.3.4 受体分析法 | 第23-27页 |
| 1.3.5 残留快速检测发展新趋势 | 第27-29页 |
| 1.4 青霉素结合蛋白 | 第29-33页 |
| 1.4.1 青霉素结合蛋白概述 | 第29-31页 |
| 1.4.2 肺炎链球菌PBPs | 第31-33页 |
| 1.4.3 PBP与β-内酰胺类药物相互作用 | 第33页 |
| 1.5 受体蛋白与小分子配体相互作用研究 | 第33-34页 |
| 1.5.1 分子对接理论 | 第34页 |
| 1.5.2 分子对接类型 | 第34页 |
| 1.6 基于定点突变的结构研究 | 第34-36页 |
| 1.6.1 体外定点突变技术 | 第35页 |
| 1.6.2 定点突变在蛋白定向改造中的应用 | 第35-36页 |
| 1.7 研究内容和方法 | 第36-37页 |
| 1.7.1 研究内容 | 第36页 |
| 1.7.2 研究方法 | 第36-37页 |
| 第二章 青霉素结合蛋白PBP3的制备 | 第37-56页 |
| 2.1 试验材料 | 第37-40页 |
| 2.1.1 菌株 | 第37页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第37-38页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第38页 |
| 2.1.4 溶液体系 | 第38-40页 |
| 2.2 试验方法 | 第40-46页 |
| 2.2.1 克隆载体pEASY-T1-pbp3的构建及鉴定 | 第40-43页 |
| 2.2.2 表达载体pET28b-pbp3的构建及鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.3 诱导表达重组蛋白PBP3 | 第44页 |
| 2.2.4 蛋白样品制备 | 第44页 |
| 2.2.5 重组蛋白纯化 | 第44页 |
| 2.2.6 重组蛋白SDS-PAGE鉴定 | 第44-45页 |
| 2.2.7 重组蛋白Western-Blotting鉴定 | 第45页 |
| 2.2.8 诱导表达条件优化 | 第45页 |
| 2.2.9 重组蛋白活性鉴定 | 第45-46页 |
| 2.3 结果与分析 | 第46-53页 |
| 2.3.1 目的基因扩增 | 第46页 |
| 2.3.2 重组克隆载体pEASY-T1-pbp3构建及鉴定 | 第46-48页 |
| 2.3.3 表达载体pET28b-pbp3的构建及鉴定 | 第48-49页 |
| 2.3.4 重组蛋白PBP3表达与纯化 | 第49页 |
| 2.3.5 PBP3诱导表达优化 | 第49-50页 |
| 2.3.6 重组蛋白PBP3活性鉴定 | 第50-51页 |
| 2.3.7 反应缓冲体系对重组蛋白PBP3活性影响 | 第51-53页 |
| 2.4 讨论 | 第53-55页 |
| 2.4.1 青霉素结合蛋白 | 第53-54页 |
| 2.4.2 表达载体选择 | 第54页 |
| 2.4.3 重组蛋白诱导表达条件优化 | 第54-55页 |
| 2.4.4 反应缓冲体系pH、离子强度及有机溶剂的影响 | 第55页 |
| 2.5 小结 | 第55-56页 |
| 第三章 基于PBP3药物多残留微孔板检测方法的建立 | 第56-74页 |
| 3.1 试验材料 | 第56-58页 |
| 3.1.1 标准品 | 第56-57页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第57页 |
| 3.1.3 溶液体系 | 第57-58页 |
| 3.2 试验方法 | 第58-60页 |
| 3.2.1 酶标记物制备 | 第58页 |
| 3.2.2 棋盘法确定受体蛋白和酶标记物工作浓度 | 第58-59页 |
| 3.2.3 基于PBP3的微孔板检测方法优化 | 第59页 |
| 3.2.4 基于PBP3的微孔板检测方法建立 | 第59页 |
| 3.2.5 标准曲线的建立 | 第59-60页 |
| 3.2.6 牛奶样品前处理 | 第60页 |
| 3.2.7 添加样品回收率 | 第60页 |
| 3.3 结果与分析 | 第60-69页 |
| 3.3.1 酶标记物的筛选 | 第60-61页 |
| 3.3.2 受体蛋白和酶标记物工作浓度确定 | 第61页 |
| 3.3.3 检测方法优化 | 第61-62页 |
| 3.3.4 标准曲线的建立 | 第62-67页 |
| 3.3.5 牛奶样品基质影响 | 第67-68页 |
| 3.3.6 牛奶样品添加回收 | 第68-69页 |
| 3.4 讨论 | 第69-73页 |
| 3.4.1 酶标物的合成 | 第69页 |
| 3.4.2 基于受体蛋白PBP3微孔检测方法的优化 | 第69-70页 |
| 3.4.3 β-内酰胺类药物多残留检测方法比较 | 第70-72页 |
| 3.4.4 前处理技术及基质效应消除 | 第72-73页 |
| 3.5 小结 | 第73-74页 |
| 第四章 基于分子对接和定点改造的PBP3结构初步研究 | 第74-101页 |
| 4.1 试验材料 | 第74-77页 |
| 4.1.1 计算机模拟软件 | 第74页 |
| 4.1.2 数据库 | 第74页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第74-76页 |
| 4.1.4 仪器设备 | 第76页 |
| 4.1.5 溶液体系 | 第76-77页 |
| 4.2 试验方法 | 第77-81页 |
| 4.2.1 PBP3与药物结合能力测定 | 第77页 |
| 4.2.2 β-内酰胺类药物和PBP3的3D结构 | 第77页 |
| 4.2.3 分子对接 | 第77-78页 |
| 4.2.4 定点改造位点的确定 | 第78-79页 |
| 4.2.5 突变引物的设计 | 第79页 |
| 4.2.6 突变菌株的获得 | 第79-81页 |
| 4.2.7 突变蛋白诱导表达纯化及活性鉴定 | 第81页 |
| 4.2.8 引入二硫键的检测 | 第81页 |
| 4.2.9 亲和力及热稳定性测定 | 第81页 |
| 4.3 结果与分析 | 第81-96页 |
| 4.3.1 结合能力测定 | 第81-84页 |
| 4.3.2 分子对接结果 | 第84-91页 |
| 4.3.3 新引入二硫键位点的确定 | 第91-92页 |
| 4.3.4 突变体诱导表达 | 第92-93页 |
| 4.3.5 新引入二硫键检测确定 | 第93-94页 |
| 4.3.6 突变体亲和力和稳定性检测 | 第94-96页 |
| 4.4 讨论 | 第96-99页 |
| 4.4.1 PBP3与β-内酰胺类药物的相互作用 | 第96-97页 |
| 4.4.2 关键氨基酸 | 第97-98页 |
| 4.4.3 突变位点的选择对蛋白亲和力与稳定性影响 | 第98-99页 |
| 4.4.4 二硫键的引入对蛋白结构和功能影响 | 第99页 |
| 4.5 小结 | 第99-101页 |
| 第五章 结论 | 第101-102页 |
| 1.制备了P-内醜胺类药物受体蛋白PBP3 | 第101页 |
| 2.建立了基于PBP3的P-内醜胺类药物微孔板式检测方法 | 第101页 |
| 3.揭示了PBP3与P-内醜胺类药物的相互作用模式 | 第101页 |
| 4.采用定点改造技术初步探索了可能影响PBP3蛋白亲和力及稳定性的结构区域 | 第101-102页 |
| 创新点 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
| 个人简历 | 第116页 |
