| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第13-22页 |
| 1.1 水稻白叶枯病及其病原菌概述 | 第13-15页 |
| 1.1.1 水稻白叶枯病的症状,分布及危害 | 第13-14页 |
| 1.1.2 水稻白叶枯病的流行特点及防治措施 | 第14页 |
| 1.1.3 水稻白叶枯病菌的形态特征 | 第14-15页 |
| 1.2. 水稻白叶枯病菌致病机理研究进展 | 第15-18页 |
| 1.2.1 水稻白叶枯病致病机理 | 第15页 |
| 1.2.2 水稻白叶枯病致病因子 | 第15-18页 |
| 1.2.2.1 胞外多糖 | 第16-17页 |
| 1.2.2.2 鞭毛 | 第17页 |
| 1.2.2.3 hrp基因 | 第17-18页 |
| 1.2.2.4 无毒基因 | 第18页 |
| 1.3 突变体库的构建 | 第18-20页 |
| 1.3.1 突变体库构建的意义 | 第18页 |
| 1.3.2 突变体库构建的方法 | 第18-20页 |
| 1.3.2.1 自发突变 | 第18-19页 |
| 1.3.2.2 诱变 | 第19页 |
| 1.3.2.3 插入突变 | 第19-20页 |
| 1.3.3 转座子Tn5插入突变在细菌功能基因组学研究的应用 | 第20页 |
| 1.4 克隆水稻白叶枯病菌致病相关基因方法 | 第20-21页 |
| 1.4.1 反向PCR | 第20页 |
| 1.4.2 TAIL-PCR法 | 第20-21页 |
| 1.4.3 质粒拯救法 | 第21页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第21-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-28页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第22页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第22-24页 |
| 2.1.3 试剂及常用溶液、培养基 | 第24-27页 |
| 2.1.3.1 抗生素、IPTG、X-gal配制 | 第24-25页 |
| 2.1.3.2 10×TBE电泳缓冲液 | 第25页 |
| 2.1.3.3 细菌质粒DNA提取试剂 | 第25页 |
| 2.1.3.4 细菌总DNA提取试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.3.5 CCMB80溶液 | 第26页 |
| 2.1.3.6 Southern杂交溶液 | 第26-27页 |
| 2.1.3.7 本研究中用到的培养基 | 第27页 |
| 2.1.5 引物 | 第27-28页 |
| 2.1.6 实验仪器 | 第28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-40页 |
| 2.2.1 常规分子生物学操作技术 | 第28-33页 |
| 2.2.1.1 细菌质粒DNA提取 | 第28-29页 |
| 2.2.1.2 黄单胞菌Xoo总DNA的提取 | 第29页 |
| 2.2.1.3 细菌DNA酶切、纯化、连接、转化 | 第29-32页 |
| 2.2.1.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第32-33页 |
| 2.2.1.5 聚合酶链式反应(PCR扩增) | 第33页 |
| 2.2.2 细菌生理生化表型检测 | 第33-34页 |
| 2.2.2.1 细菌菌落形态检测 | 第33-34页 |
| 2.2.2.2 细菌游动性检测 | 第34页 |
| 2.2.2.3 细菌生长曲线检测 | 第34页 |
| 2.2.3 突变体库的构建 | 第34-35页 |
| 2.2.3.1 菌种的活化、培养 | 第34页 |
| 2.2.3.2 黄单胞菌电转感受态的制备 | 第34-35页 |
| 2.2.3.3 电脉冲转化 | 第35页 |
| 2.2.3.4 菌种的保存 | 第35页 |
| 2.2.4 剪叶法致病力分析 | 第35-36页 |
| 2.2.5 致病力降低的突变体Tn5插入位点的定位 | 第36页 |
| 2.2.6 生物信息学分析 | 第36页 |
| 2.2.7 验证突变体库中Tn5插入拷贝数 | 第36-39页 |
| 2.2.7.1 制备探针 | 第36页 |
| 2.2.7.2 核酸转移 | 第36-37页 |
| 2.2.7.3 紫外交联 | 第37页 |
| 2.2.7.4 预杂交 | 第37-38页 |
| 2.2.7.5 杂交 | 第38页 |
| 2.2.7.6 洗膜、显影 | 第38-39页 |
| 2.2.8 反式互补菌株的构建 | 第39-40页 |
| 2.2.8.1 三亲本结合 | 第39页 |
| 2.2.8.2 重组载体构建 | 第39-40页 |
| 第三章 结果与分析 | 第40-57页 |
| 3.1 突变体库的构建 | 第40页 |
| 3.2 水稻白叶枯病菌K74 Tn5随机插入突变体库检验 | 第40-44页 |
| 3.2.1 PCR检验结果及分析 | 第40-41页 |
| 3.2.2 Tn5插入拷贝数检验及分析 | 第41-44页 |
| 3.2.2.1 提取Tn5插入突变体基因组DNA并检测其质量 | 第42页 |
| 3.2.2.2 酶切效果检测 | 第42-43页 |
| 3.2.2.3 探针标记检测 | 第43-44页 |
| 3.2.2.4 Southern杂交结果及分析 | 第44页 |
| 3.3 Tn5插入突变体表型分析 | 第44-46页 |
| 3.3.1 剪叶法致病力分析 | 第45-46页 |
| 3.4 表型明显突变体Tn5插入位点定位及生物信息学分析 | 第46-48页 |
| 3.4.1 质粒拯救 | 第46-47页 |
| 3.4.2 生物信息学分析 | 第47-48页 |
| 3.5 wxoC基因功能探究 | 第48-57页 |
| 3.5.1 wxoC基因基本信息 | 第48-49页 |
| 3.5.2 wxoC基因Tn5插入突变体信息 | 第49-50页 |
| 3.5.3 wxoC基因互补菌株的构建 | 第50-53页 |
| 3.5.3.1 wxoC互补片段的扩增 | 第50-51页 |
| 3.5.3.2 重组质粒pk18mobsacBwxoC的构建 | 第51-52页 |
| 3.5.3.3 重组质粒pLAFRJ wxoC的构建 | 第52页 |
| 3.5.3.4 三亲本结合、互补菌株的验证 | 第52-53页 |
| 3.5.4 互补菌株生理生化特性分析 | 第53-57页 |
| 3.5.4.1 致病力检测 | 第53-54页 |
| 3.5.4.2 菌落形态分析 | 第54-55页 |
| 3.5.4.3 游动性检测 | 第55-56页 |
| 3.5.4.4 生长曲线测定 | 第56-57页 |
| 第四章 LPS基因簇多样性分析 | 第57-59页 |
| 第五章 总结与讨论 | 第59-62页 |
| 5.1 对Tn5插入突变体库的评价及分析 | 第59页 |
| 5.2 对突变体库表型筛选及插入位点定位的分析 | 第59-60页 |
| 5.3 对Xoo K74中wxoC基因功能的分析 | 第60-61页 |
| 5.4 后续工作 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 攻读学位期间论文发表情况 | 第73页 |
