| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 缩略词表 | 第10-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-61页 |
| 1. PGCs起源与早期发育 | 第19-31页 |
| 1.1 PGCs的起源与迁移 | 第19-20页 |
| 1.2 PGCs的生物学特性 | 第20页 |
| 1.3 PGCs形成的调控机制 | 第20-31页 |
| 1.3.1 PGCs形成的分子调控 | 第20-26页 |
| 1.3.1.1 细胞因子调节PGCs形成 | 第20-22页 |
| 1.3.1.2 RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)调节PGCs形成 | 第22-24页 |
| 1.3.1.3 关键基因调节PGCs形成 | 第24-26页 |
| 1.3.2 PGCs形成的信号通路调控 | 第26-30页 |
| 1.3.3 磷酸化和泛素化修饰在细胞分化过程中的研究进展 | 第30-31页 |
| 1.3.3.1 磷酸化修饰在细胞分化过程中的研究进展 | 第30页 |
| 1.3.3.2 泛素化修饰在细胞分化过程中的研究进展 | 第30-31页 |
| 2. 基因敲除方法研究进展 | 第31-39页 |
| 2.1 基因敲除方法简介 | 第31-32页 |
| 2.2 CRISPR/Cas9基因敲除技术简介 | 第32-39页 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas的发现和结构 | 第32-34页 |
| 2.2.2 CRISPR-Cas系统的工作过程 | 第34页 |
| 2.2.3 CRISPR的体外改造 | 第34-35页 |
| 2.2.4 gRNA的设计 | 第35页 |
| 2.2.5 gRNA的活性检测 | 第35-37页 |
| 2.2.5.1 限制性内切酶法 | 第35-36页 |
| 2.2.5.2 非配对内切酶法-T7E1法 | 第36页 |
| 2.2.5.3 SSA活性检测 | 第36-37页 |
| 2.2.6 cas9/sgRNA系统的应用 | 第37-38页 |
| 2.2.6.1 cas9/sgRNA系统细胞水平进行基因的修饰 | 第37页 |
| 2.2.6.2 cas9/sgRNA系统个体水平进行基因的修饰 | 第37-38页 |
| 2.2.7 CRISPR/Cas存在的问题 | 第38页 |
| 2.2.8 CRISPR/Cas系统应用展望 | 第38-39页 |
| 3 本课题前期新发现 | 第39页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第39-41页 |
| 5 参考文献 | 第41-61页 |
| 第二章 C2EIP筛选、克隆及生物信息学分析 | 第61-77页 |
| 1 材料与方法 | 第61-65页 |
| 1.1 实验材料 | 第61页 |
| 1.2 实验试剂 | 第61页 |
| 1.3 主要仪器和设备 | 第61页 |
| 1.4 鸡4.5d生殖嵴cDNA构建 | 第61-63页 |
| 1.4.1 鸡4.5d生殖嵴RNA提取 | 第61-62页 |
| 1.4.2 鸡4.5d生殖嵴cDNA文库构建 | 第62-63页 |
| 1.5 C2EIP克隆 | 第63页 |
| 1.6 C2EIP在不同组织和细胞中的表达检测 | 第63-64页 |
| 1.7 C2EIP生物信息学分析 | 第64-65页 |
| 2 结果 | 第65-73页 |
| 2.0 C2EIP筛选 | 第65-66页 |
| 2.1 C2EIP克隆及表达检测 | 第66-67页 |
| 2.2 C2EIP CDS序列生物信息学分析 | 第67-73页 |
| 2.2.1 C2EIP ORF预测 | 第67页 |
| 2.2.2 C2EIP蛋白理化性质分析 | 第67-68页 |
| 2.2.3 C2EP蛋白二级,三级结构分析 | 第68-69页 |
| 2.2.4 C2EIP蛋白疏水性预测 | 第69页 |
| 2.2.5 C2EIP信号肽预测和亚细胞定位预测 | 第69-71页 |
| 2.2.6 C2EIP蛋白功能结构域预测 | 第71页 |
| 2.2.7 C2EIP其他修饰位点预测 | 第71-72页 |
| 2.2.8 C2EIP及蛋白质的同源分析 | 第72-73页 |
| 3 讨论 | 第73-74页 |
| 4 本章小结 | 第74页 |
| 5 参考文献 | 第74-77页 |
| 第三章 C2EIP在PGCs形成过程中的功能研究 | 第77-113页 |
| 1 材料与方法 | 第77-90页 |
| 1.1 实验材料 | 第77-78页 |
| 1.2 实验试剂 | 第78页 |
| 1.3 主要仪器和设备 | 第78页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9基因编辑技术介导家鸡C2EIP敲除体系建立 | 第78-83页 |
| 1.4.1 C2EIP克隆与靶位点选择 | 第78-79页 |
| 1.4.2 cas9/gRNA表达载体构建 | 第79-80页 |
| 1.4.3 细胞转染 | 第80页 |
| 1.4.4 敲除载体活性检测 | 第80-83页 |
| 1.4.4.1 Luciferase-SSA报告载体活性检测 | 第80页 |
| 1.4.4.2 T7E1酶切试验 | 第80-82页 |
| 1.4.4.3 TA克隆测序分析 | 第82页 |
| 1.4.4.4 荧光定量PCR检测 | 第82-83页 |
| 1.4.4.5 蛋白质印迹(Western blot) | 第83页 |
| 1.5 PCDNA3.0-C2EIP载体和C2EIP-N1融合表达载体构建 | 第83-86页 |
| 1.5.1引物设计与合成 | 第83页 |
| 1.5.2 载体构建 | 第83-86页 |
| 1.6 C2EIP亚细胞地位研究 | 第86页 |
| 1.6.1 C2EIP亚细胞定位预测 | 第86页 |
| 1.6.2 C2EIP-N1转染及细胞表达定位 | 第86页 |
| 1.7 C2EIP多克隆抗体制备 | 第86-87页 |
| 1.7.1 C2EIP抗原表位设计 | 第86-87页 |
| 1.7.2 C2EIP抗原注射和抗血清收集 | 第87页 |
| 1.7.3 C2EIP多克隆抗体效价检测 | 第87页 |
| 1.8 体外研究C2EIP在PGCs形成过程中的功能 | 第87-89页 |
| 1.8.1 细胞分组及处理 | 第87-88页 |
| 1.8.2 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PGCs形成相关基因表达 | 第88页 |
| 1.8.3 Western Blot检测PGCs形成相关基因表达 | 第88-89页 |
| 1.8.4 间接免疫荧光以及流式细胞分选检测PGCs形成效率 | 第89页 |
| 1.9 体内研究C2EIP在PGCs形成过程中的功能 | 第89-90页 |
| 1.9.1 鸡胚孵化分组及处理 | 第89页 |
| 1.9.2 实时观察和冰冻切片外源载体在鸡胚基因组中的整合与表达 | 第89页 |
| 1.9.3 PGCs分化指标检测 | 第89页 |
| 1.9.4 免疫组化检测各组生殖嵴发育 | 第89-90页 |
| 1.10 数据分析 | 第90页 |
| 2 结果 | 第90-107页 |
| 2.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术介导家鸡C2EIP敲除体系建立 | 第90-96页 |
| 2.1.1 CRISPR/Cas9载体改造 | 第90-91页 |
| 2.1.2 C2EIP克隆与cas9/gRNA表达载体构建 | 第91-92页 |
| 2.1.3 CRISPR/Cas9-gRNA (cas9/gRNA)敲除载体在DF-1细胞中的敲除活性检测 | 第92-96页 |
| 2.1.3.1 Luciferase-SSA报告载体法检测cas9/gRNA载体基因敲除活性 | 第92-93页 |
| 2.1.3.2 T7E1酶切检测靶向C2EIP cas9/gRNA3的活性 | 第93-94页 |
| 2.1.3.3 TA克隆测序分析cas9/gRNA3基因敲除效率 | 第94页 |
| 2.1.3.4 Cas9/gRNA3脱靶效率检测 | 第94-96页 |
| 2.2 CRISPR/Cas系统能够在鸡胚胎干细胞上有效的介导基因缺失 | 第96页 |
| 2.3 CRISPR/Cas系统能够在鸡胚胎上有效的介导基因缺失 | 第96-98页 |
| 2.4 PCDNA3.0-C2EIP载体和C2EIP-N1融合表达载体构建 | 第98-99页 |
| 2.5 C2EIP亚细胞定位研究 | 第99页 |
| 2.6 C2EIP多克隆抗体效价检测 | 第99-100页 |
| 2.7 体外研究C2EIP在PGCs形成过程中的功能 | 第100-104页 |
| 2.7.1 不同C2EIP表达水平PGCs形成过程中细胞形态变化 | 第100-101页 |
| 2.7.2 体外不同C2EIP表达水平PGCs形成指标检测 | 第101-104页 |
| 2.8 体内研究C2EIP在PGCs形成过程中的功能 | 第104-107页 |
| 2.8.1 报告载体在鸡胚发育过程中的表达情况检测 | 第104-105页 |
| 2.8.2 体内不同C2EIP表达水平PGCs形成指标检测 | 第105-107页 |
| 3 讨论 | 第107-109页 |
| 4 本章小结 | 第109-110页 |
| 5 参考文献 | 第110-113页 |
| 第四章 探索影响C2EIP表达的因素 | 第113-143页 |
| 1 材料与方法 | 第113-124页 |
| 1.1 实验材料 | 第113页 |
| 1.2 实验试剂 | 第113-115页 |
| 1.3 主要仪器和设备 | 第115页 |
| 1.4 引物设计与合成 | 第115-116页 |
| 1.5 如皋黄鸡基因组提取 | 第116页 |
| 1.6 C2EIP启动子活性定性分析 | 第116-119页 |
| 1.6.1 真核表达载体PC2EIP-EGFP的构建 | 第116-118页 |
| 1.6.2 DF-1细胞培养与转染 | 第118-119页 |
| 1.6.3 启动子活性定性分析 | 第119页 |
| 1.7 C2EIP启动子核心区域筛选 | 第119-120页 |
| 1.7.1 C2EIP启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建 | 第119页 |
| 1.7.2 PGL3-basic重组载体鉴定及命名 | 第119页 |
| 1.7.3 C2EIP启动子核心区域筛选 | 第119-120页 |
| 1.8 C2EIP启动子核心区域关键转录因子筛选 | 第120-123页 |
| 1.9 DNA甲基化和组蛋白乙酰化对启动子活性的影响 | 第123-124页 |
| 1.9.1 DNA甲基化抑制剂(5-Azadc)对启动子活性的影响 | 第123页 |
| 1.9.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)对启动子活性的影响 | 第123页 |
| 1.9.3 5-Azadc和TSA对PGCs中C2EIP基因表达变化的影响 | 第123-124页 |
| 1.10 数据分析 | 第124页 |
| 2 结果 | 第124-136页 |
| 2.1 C2EIP启动子活性分析 | 第124-125页 |
| 2.1.1 真核表达载体PC2EIP-EGFP构建 | 第124-125页 |
| 2.1.2 C2EIP启动子活性分析 | 第125页 |
| 2.2 C2EIP启动子核心区域筛选 | 第125-128页 |
| 2.2.1 C2EIP启动子不同长度区缺失片段扩增及缺失载体构建 | 第125-127页 |
| 2.2.2 C2EIP启动子核心区域筛选 | 第127-128页 |
| 2.3 转录因子调节C2EIP启动子活性 | 第128-135页 |
| 2.3.1 C2EIP启动子核心区域转录因子结合位点预测及点突变 | 第128-133页 |
| 2.3.2 转录因子调节C2EIP启动子启动活性 | 第133-135页 |
| 2.4 DNA甲基化和组蛋白乙酰化调节C2EIP启动子启动活性 | 第135-136页 |
| 3 讨论 | 第136-138页 |
| 4 本章小结 | 第138页 |
| 5 参考文献 | 第138-143页 |
| 第五章 C2EIP参与PTCH2泛素化和去磷酸化而激活HH信号调节PGCs生成 | 第143-174页 |
| 1 材料与方法 | 第143-152页 |
| 1.1 实验材料 | 第143页 |
| 1.2 实验试剂 | 第143-144页 |
| 1.3 主要仪器和设备 | 第144页 |
| 1.4 基于GST-PullD own技术筛选C2EIP互作蛋白 | 第144-146页 |
| 1.4.1 C2EIP克隆以及原核表达载体构建 | 第144页 |
| 1.4.2 Pet-49(b)-GST-目的基因进行原核表达 | 第144页 |
| 1.4.3 蛋白大量表达和破菌检测 | 第144-145页 |
| 1.4.4 蛋白纯化和浓缩 | 第145页 |
| 1.4.5 GST-Pull Down试验 | 第145页 |
| 1.4.6 蛋白质还原烷基化和胶内酶解及LC-MSMS鉴定 | 第145-146页 |
| 1.4.7 GST-Pull Down蛋白表达鉴定 | 第146页 |
| 1.5 PTCH2蛋白磷酸化和泛素化水平检测 | 第146-147页 |
| 1.5.1 细胞收集 | 第146页 |
| 1.5.2 组织收集 | 第146-147页 |
| 1.5.3 免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation) | 第147页 |
| 1.5.3.1 蛋白提取 | 第147页 |
| 1.5.3.2 免疫沉淀 | 第147页 |
| 1.5.4 Western Blot检测PTCH2蛋白磷酸化和泛素化水平变化 | 第147页 |
| 1.6 HH信号通路在PGCs形成过程中的功能研究 | 第147-152页 |
| 1.6.1 PTCH2干扰表达载体构建 | 第147-150页 |
| 1.6.1.1 shRNA靶点的选择和shRNA引物的设计 | 第147-148页 |
| 1.6.1.2 shRNA慢病毒重组质粒的构建 | 第148-149页 |
| 1.6.1.3 慢病毒载体活性检测 | 第149页 |
| 1.6.1.4 病毒包裹 | 第149-150页 |
| 1.6.1.5 Lentivirus滴度测定 | 第150页 |
| 1.6.2 体外研究HH信号通路在PGCs形成过程中的功能 | 第150-151页 |
| 1.6.2.1 细胞分组及处理 | 第150-151页 |
| 1.6.2.2 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PGCs形成相关基因表达 | 第151页 |
| 1.6.2.3 间接免疫荧光以及流式细胞分选检测PGCs形成效率 | 第151页 |
| 1.6.3 体内研究HH信号通路在PGCs形成过程中的功能 | 第151-152页 |
| 1.6.3.1 鸡胚孵化分组及处理 | 第151页 |
| 1.6.3.2 外源载体在鸡胚基因组中的整合与表达 | 第151页 |
| 1.6.3.3 PGCs分化指标检测 | 第151页 |
| 1.6.3.4 PAS染色检测各组PGCs发育 | 第151-152页 |
| 1.7 数据分析 | 第152页 |
| 2 结果 | 第152-167页 |
| 2.1 基于GST-Pull Down技术筛选C2EIP互作蛋白 | 第152-156页 |
| 2.1.1 C2EIP原核融合表达载体构建 | 第152-153页 |
| 2.1.2 C2EIP原核融合表达载体诱导表达和鉴定 | 第153页 |
| 2.1.3 C2EIP GST Pull Down以及质谱分析 | 第153-155页 |
| 2.1.4 C2EIP蛋白与PTCH2蛋白互作鉴定 | 第155-156页 |
| 2.2 PGCs正常发生过程中PTCH2蛋白的磷酸化和泛素化水平变化 | 第156-159页 |
| 2.2.1 体内孵化过程中ESCs,PGCs和SSCs收集 | 第156页 |
| 2.2.2 PTCH2蛋白在体内生殖细胞分化过程中的动态变化 | 第156-157页 |
| 2.2.3 PTCH2蛋白的磷酸化和泛素化水平检测 | 第157-158页 |
| 2.2.4 PGCs体外诱导过程中PTCH2蛋白的磷酸化和泛素化水平变化 | 第158-159页 |
| 2.3 shRNA-PTCH2慢病毒载体构建 | 第159-161页 |
| 2.3.1 shRNA-PTCH2载体活性检测 | 第159-161页 |
| 2.3.2 慢病毒包装与滴度测定 | 第161页 |
| 2.4 HH信号通路体外PGCs形成过程中功能验证 | 第161-165页 |
| 2.4.1 HH信号通路的抑制和激活 | 第161-162页 |
| 2.4.2 HH信号通路抑制/激活后ESCs向生殖细胞诱导分化指标检测 | 第162-165页 |
| 2.5 HH信号通路体内PGCs形成过程中功能研究 | 第165-167页 |
| 2.5.1 HH信号通路的抑制和激活 | 第165页 |
| 2.5.2 HH信号通路抑制/激活后体内生殖细胞分化指标检测 | 第165-167页 |
| 3 讨论 | 第167-170页 |
| 4 本章小结 | 第170页 |
| 5 参考文献 | 第170-174页 |
| 结论和创新点 | 第174-176页 |
| 结论 | 第174页 |
| 创新点 | 第174-176页 |
| 论文有待改进之处及下一步计划 | 第176-177页 |
| 论文有待改进之处 | 第176页 |
| 下一步计划 | 第176-177页 |
| 致谢 | 第177-179页 |
| 博士期间发表的论文 | 第179-182页 |
