| 目录 | 第1-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 前言 | 第11-21页 |
| 1.以动脉粥样硬化为基础的心脑血管疾病对人类健康危害严重 | 第11页 |
| 2.动脉粥样硬化发生是一个多因素多环节的漫长过程 | 第11-14页 |
| ·动脉粥样硬化的复杂病理过程 | 第11-13页 |
| ·动脉粥样硬化可通过多条途径发生,有多种因素参与 | 第13-14页 |
| 3.内皮细胞功能失常是动脉粥样硬化发生的重要环节 | 第14-16页 |
| 4.人SIRT1的功能提示它可能具有抗内皮细胞功能失常的作用 | 第16-19页 |
| 5.SIRT1对动脉粥样硬化是否有抑制作用是本研究的要点 | 第19-21页 |
| 实验材料 | 第21-24页 |
| 1.质粒 | 第21-22页 |
| 2.菌株 | 第22页 |
| 3.实验用小鼠及饲料 | 第22页 |
| 4.限制性内切酶和其他修饰酶 | 第22页 |
| 5.其他主要试剂 | 第22-23页 |
| 6.放射性核素 | 第23页 |
| 7.主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 实验方法 | 第24-47页 |
| 1.克隆构建 | 第24-27页 |
| ·用于制备转基因的VE-SIRT1的克隆构建 | 第24-26页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第24页 |
| ·酶切与回收 | 第24页 |
| ·连接反应 | 第24-25页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第25页 |
| ·感受态细胞的转化与克隆筛选 | 第25页 |
| ·测序鉴定正确的VE-SIRT1质粒克隆 | 第25-26页 |
| ·用于细胞转染的pcDNA3.1-SIRT1WT和pcDNA3.1-SIRT1H363Y的质粒的构建 | 第26页 |
| ·SIRT1 RNA干扰质粒的构建 | 第26-27页 |
| 2.显微注射用质粒DNA的制备与纯化 | 第27-28页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第27-28页 |
| ·质粒DNA的酶切与纯化 | 第28页 |
| 3.受精卵培养基的配制与保存 | 第28-30页 |
| ·M2和M16储存液的成分及配制 | 第28-29页 |
| ·M2和M16工作液的配制 | 第29-30页 |
| 4.小鼠的选择与处理 | 第30页 |
| 5.超排卵和取卵 | 第30-31页 |
| 6.显微注射 | 第31-34页 |
| ·持卵针的制备 | 第31页 |
| ·显微注射针的拉制 | 第31-32页 |
| ·显微注射槽的制备 | 第32页 |
| ·显微注射 | 第32-34页 |
| 7.输卵管移卵 | 第34-36页 |
| ·移卵针的制备 | 第34页 |
| ·受精卵在移卵针中的排列 | 第34页 |
| ·输卵管移卵 | 第34-36页 |
| 8.转基因鼠的检测 | 第36-38页 |
| ·利用PCR鉴定转基因鼠 | 第36页 |
| ·利用Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第36-38页 |
| ·鼠尾基因组DNA的提取 | 第36-37页 |
| ·Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第37-38页 |
| 9.转基因鼠的传代,与apoE~(-/-)鼠的杂交和基因型鉴定,喂高脂饮食诱发动脉粥样硬化 | 第38页 |
| ·转基因鼠传代 | 第38页 |
| ·转基因鼠与apoE~(-/-)鼠的杂交和基因型鉴定 | 第38页 |
| ·喂高脂饮食诱发动脉粥样硬化 | 第38页 |
| 10.小鼠组织器官的采集和保存 | 第38-39页 |
| 11.组织RNA提取 | 第39-40页 |
| 12.逆转录PCR(RT-PCR) | 第40页 |
| 13.组织蛋白提取部分 | 第40-41页 |
| ·蛋白提取缓冲液RIPA的成分 | 第40页 |
| ·用RIPA缓冲液提取组织蛋白 | 第40-41页 |
| 14.Western blot | 第41-42页 |
| ·变性PAGE胶电泳 | 第41页 |
| ·转膜 | 第41-42页 |
| ·免疫反应 | 第42页 |
| ·ECL反应 | 第42页 |
| 15.组织切片、油红O(oil red O)染色和免疫荧光 | 第42-43页 |
| ·组织切片 | 第42页 |
| ·改良油红O染色法 | 第42-43页 |
| ·免疫荧光 | 第43页 |
| 16.小鼠主动脉整体油红O染色、动脉粥样斑块分析 | 第43-44页 |
| ·主动脉整体油红O染色 | 第43页 |
| ·粥样斑块分析 | 第43-44页 |
| 17.小鼠血脂血糖浓度测定 | 第44页 |
| 18.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)相关实验 | 第44-46页 |
| ·HUVEC的分离培养 | 第44页 |
| ·HUVEC的鉴定 | 第44-45页 |
| ·oxLDL刺激HUVEC | 第45页 |
| ·免疫组化 | 第45-46页 |
| ·免疫荧光 | 第46页 |
| 19.双荧光素酶报告系统测定启动子活性 | 第46页 |
| 20.统计学方法 | 第46-47页 |
| 实验结果 | 第47-64页 |
| 1.正常内皮细胞有SIRT1表达 | 第47-49页 |
| ·HUVEC的分离和鉴定 | 第47页 |
| ·HUVEC有SIRT1的表达 | 第47-48页 |
| ·HUVEC经oxLDL作用后SIRT1表达上调 | 第48-49页 |
| 2.VE-SIRT1质粒克隆的构建 | 第49-50页 |
| 3.显微注射用DNA的制备 | 第50-51页 |
| 4.VE-SIRT1转基因鼠系的建立 | 第51-52页 |
| 5.转基因在动物体内正确的组织特异性表达 | 第52-54页 |
| 6.SIRT1~+/apoE~(-/-)鼠系的建立 | 第54页 |
| 7.内皮细胞过表达SIRT1对动脉粥样硬化的发生有抑制作用 | 第54-57页 |
| 8.喂高脂饮食10周后转基因鼠与对照鼠的体重没有差异 | 第57-58页 |
| 9.SIRT1在内皮细胞过表达不影响血脂和血糖水平 | 第58-59页 |
| 10.SIRT1上调内皮细胞eNOS基因表达水平 | 第59-60页 |
| 11.SIRT1可增加eNOS启动子活性 | 第60-61页 |
| 12.SIRT1可与FOXO3a共同调节eNOS启动子活性 | 第61-64页 |
| 讨论 | 第64-75页 |
| 1.SIRT1与动脉粥样硬化相关性的线索 | 第64-67页 |
| ·SIRT1可能具有抗动脉粥样硬化功能的线索:代谢调节与抗应激 | 第64-66页 |
| ·选择内皮细胞作为研究对象:针对性强 | 第66-67页 |
| 2.SIRT1在内皮细胞过表达可以在较早期抑制动脉粥样硬化的发生 | 第67-70页 |
| ·喂10周高脂饮食的转基因雄性鼠动脉粥样硬化病变较对照鼠轻 | 第68-69页 |
| ·喂20周高脂饮食的转基因鼠动脉粥样硬化与对照鼠无显著性差异 | 第69-70页 |
| ·SIRT1是一个新的抗动脉粥样硬化因素 | 第70页 |
| 3.SIRT1抑制动脉粥样硬化的机制探索—增加eNOS基因转录 | 第70-73页 |
| ·SIRT1参与eNOS基因转录激活的调节 | 第71-72页 |
| ·SIRT1对eNOS的调节可以部分解释代谢调节与内皮功能的关系 | 第72-73页 |
| 4.SIRT1抑制动脉粥样硬化发生的机制总结 | 第73-74页 |
| 5.本研究的不足与展望 | 第74-75页 |
| 小结 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 文献综述 动脉粥样硬化的基础研究—历史回顾与展望 | 第81-95页 |
| 一、危险因素(risk factor)概念的确立,多种遗传和环境危险因素的发现和证实 | 第82-83页 |
| 二、脂类与动脉粥样硬化关系的研究,他汀(statin)类药物应用的成果 | 第83-84页 |
| 三、不只是胆固醇—炎症理论的确立 | 第84-86页 |
| 四、衰老的作用 | 第86-87页 |
| 五、展望 | 第87-89页 |
| 1.更新基本观念 | 第87-88页 |
| 2.发病机理的研究 | 第88页 |
| 3.药物治疗 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-95页 |
| 英文名词及缩写 | 第95-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 个人简历 | 第98-100页 |
