| 摘要 | 第1-3页 |
| ABSTRACT | 第3-7页 |
| 第一章 前言 | 第7-20页 |
| 1 板栗疫病菌与低毒病毒 | 第7-12页 |
| ·板栗疫病与板栗疫病菌 | 第7页 |
| ·板栗疫病菌中的低毒力现象 | 第7-8页 |
| ·低毒病毒 | 第8-9页 |
| ·板栗疫病菌与低毒病毒相互作用研究 | 第9-12页 |
| ·低毒力相关的蛋白酶 | 第9-10页 |
| ·G蛋白信号传导对真菌毒力的影响 | 第10-11页 |
| ·肌醇三磷酸(IP3)/Ca2+/钙调蛋白信号传导途径对真菌毒力的影响 | 第11页 |
| ·板栗疫病菌cDNA芯片在研究低毒病毒/板栗疫病菌相互作用上的应用 | 第11-12页 |
| 2 RNA沉默及其在真菌研究中的应用 | 第12-19页 |
| ·RNA沉默的发现 | 第12-13页 |
| ·RNA沉默的分子机制 | 第13-14页 |
| ·真菌中的RNA沉默现象 | 第14-16页 |
| ·Quelling | 第14-15页 |
| ·MSUD | 第15-16页 |
| ·RNA沉默在真菌研究中的优势和不足 | 第16-17页 |
| ·RNA沉默在真菌中的应用 | 第17-18页 |
| ·RNA沉默在丝状真菌基因功能研究中的应用 | 第18-19页 |
| 3 课题研究目的和意义 | 第19-20页 |
| 第二章 材料和方法 | 第20-36页 |
| 1 菌种 | 第20页 |
| ·细菌菌种 | 第20页 |
| ·真菌菌种 | 第20页 |
| ·质粒 | 第20页 |
| 2 培养基及培养条件 | 第20-22页 |
| ·大肠杆菌培养基 | 第20-21页 |
| ·LB培养基 | 第20-21页 |
| ·LA培养基 | 第21页 |
| ·板栗疫病菌培养基 | 第21-22页 |
| ·PDA培养基 | 第21页 |
| ·EP完全培养基 | 第21-22页 |
| ·菌株培养条件 | 第22页 |
| 3 抗生素及其使用浓度 | 第22页 |
| 4 质粒DNA的提取 | 第22-24页 |
| ·质粒DNA的小规模提取 | 第22-23页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第23-24页 |
| ·溶液中蛋白质及RNA的去除 | 第24页 |
| 5 DNA的酶切 | 第24-25页 |
| 6 DNA片段的回收 | 第25页 |
| 7 DNA的连接反应 | 第25页 |
| 8 质粒DNA的转化 | 第25-27页 |
| ·甘油法制备E.coli的感受态细胞 | 第25-26页 |
| ·氯化铷法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第26页 |
| ·质粒DNA的电脉冲转化 | 第26页 |
| ·质粒DNA的热击转化 | 第26-27页 |
| 9 PCR反应 | 第27页 |
| ·PCR反应体系 | 第27页 |
| ·PCR反应条件 | 第27页 |
| 10 真菌原生质体的制备 | 第27-29页 |
| 11 真菌原生质体转化 | 第29页 |
| 12 丝状真菌总DNA的提取 | 第29-30页 |
| 13 丝状真菌总RNA的提取 | 第30-31页 |
| 14 荧光定量PCR | 第31-33页 |
| ·引物设计 | 第31-32页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第32页 |
| ·荧光定量PCR | 第32-33页 |
| 15 Southern杂交 | 第33-36页 |
| ·向下毛细管转移法进行Southern印迹 | 第33-34页 |
| ·DNA印迹的杂交分析 | 第34-36页 |
| ·预杂交 | 第34-35页 |
| ·探针标记 | 第35页 |
| ·洗膜 | 第35-36页 |
| 第三章 结果与分析 | 第36-56页 |
| 1 RNA干扰载体的构建以及验证 | 第36-45页 |
| ·RNA干扰载体的构建 | 第36-37页 |
| ·板栗疫病菌漆酶基因(lac-1)的RNA干扰 | 第37-45页 |
| ·含发夹结构lac-1 RNA干扰质粒的构建 | 第38-42页 |
| ·lac-1融合片断和内含子序列的获得 | 第38-39页 |
| ·融合PCR连接lac-1 RNA干扰片断和内含子 | 第39-41页 |
| ·pFC-lac(+)质粒的构建 | 第41页 |
| ·lac-1 RNA干扰质粒pFC-lac(+/-)的构建 | 第41-42页 |
| ·EP155漆酶基因(lac-1)的RNA干扰 | 第42-45页 |
| ·阳性转化子的PCR检测 | 第43页 |
| ·lac-1 RNA干扰株漆酶表达量的观察 | 第43-44页 |
| ·lac-1干扰株漆酶相对表达量分析 | 第44-45页 |
| 2 RNA干扰载体的优化 | 第45-56页 |
| ·pFCNH的优化 | 第46页 |
| ·绿色荧光蛋白基因(GFP)的RNA干扰 | 第46-56页 |
| ·板栗疫病菌绿色荧光蛋白基因(GFP)表达株的构建 | 第47-48页 |
| ·绿色荧光蛋白基因(GFP)表达质粒的构建 | 第47-48页 |
| ·绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达株GFP/EP155的获得 | 第48页 |
| ·绿色荧光蛋白基因(GFP)RNA干扰质粒的构建 | 第48-51页 |
| ·GFP RNA干扰质粒正向干扰片断的克隆 | 第50页 |
| ·GFP RNA干扰质粒反向干扰片断的克隆 | 第50-51页 |
| ·GFP的RNA干扰 | 第51-56页 |
| ·GFP RNA干扰阳性转化株的筛选 | 第51-52页 |
| ·荧光显微镜观察干扰效果 | 第52-53页 |
| ·实时荧光定量PCR检测干扰效率 | 第53-54页 |
| ·GFP RNA干扰转化子的SOUTHERN杂交分析 | 第54-56页 |
| 第四章 讨论 | 第56-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 附录1 实验中用到的主要仪器 | 第67页 |
