| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 缩写 | 第11-12页 |
| 第1章 绪论 | 第12-35页 |
| ·蒽环类抗生素简介 | 第12-16页 |
| ·柔红霉素 | 第12-13页 |
| ·阿霉素 | 第13页 |
| ·表阿霉素 | 第13-14页 |
| ·作用机制 | 第14页 |
| ·表阿霉素的化学半合成方法 | 第14-16页 |
| ·柔红霉素的生物合成途径 | 第16-19页 |
| ·第一阶段 ε-紫红霉酮的生成 | 第17页 |
| ·第二阶段 TDP-柔红糖胺的合成及糖苷化反应 | 第17-19页 |
| ·第三阶段 后修饰形成柔红霉素及阿霉素 | 第19页 |
| ·链霉菌中基因敲除和基因置换 | 第19-27页 |
| ·常用方法 | 第19-23页 |
| ·选择方法时的考虑因素 | 第23-24页 |
| ·同源片段的导入方法 | 第24-25页 |
| ·选择标记 | 第25-27页 |
| ·抗生素分子中脱氧糖组合生物合成 | 第27-33页 |
| ·糖生物合成基因 | 第27-29页 |
| ·糖苷转移酶基因 | 第29页 |
| ·糖C4酮基还原酶基因 | 第29-30页 |
| ·利用产生菌作为细胞工厂改造脱氧糖结构 | 第30-32页 |
| ·用非产生菌做细胞工厂改造脱氧糖结构 | 第32-33页 |
| ·体外随机糖苷化 | 第33页 |
| ·本工作的立题意义及研究内容 | 第33-35页 |
| 第2章 C4酮基还原酶基因的克隆及序列分析 | 第35-59页 |
| ·实验材料 | 第35-38页 |
| ·菌种和质粒 | 第35-36页 |
| ·培养基 | 第36-37页 |
| ·试剂 | 第37-38页 |
| ·主要仪器和设备 | 第38页 |
| ·实验方法 | 第38-43页 |
| ·菌种的培养和保藏 | 第38-39页 |
| ·链霉菌基因组DNA的提取 | 第39页 |
| ·PCR反应体系 | 第39-40页 |
| ·PCR反应程序 | 第40页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第40-41页 |
| ·大肠杆菌质粒转化(CaCl_2法) | 第41页 |
| ·大肠杆菌质粒分离 | 第41-42页 |
| ·DNA片段的回收 | 第42页 |
| ·PCR产物亚克隆 | 第42页 |
| ·分析软件 | 第42-43页 |
| ·实验结果 | 第43-57页 |
| ·dnmU+dnmV连锁基因的克隆分析 | 第43-47页 |
| ·PCR扩增dnmV基因及其亚克隆 | 第47-48页 |
| ·几种抗生素产生菌基因组的提取 | 第48-49页 |
| ·aveBIV基因的克隆分析 | 第49-52页 |
| ·oleU基因的克隆分析 | 第52-55页 |
| ·novS基因的克隆分析 | 第55-57页 |
| ·实验讨论 | 第57-58页 |
| ·结论 | 第58-59页 |
| 第3章 dnmV基因的阻断(一)——同源重组单交换法 | 第59-76页 |
| ·实验材料 | 第59-62页 |
| ·菌种和质粒 | 第59-60页 |
| ·培养基 | 第60-61页 |
| ·主要溶液和缓冲液 | 第61页 |
| ·试剂 | 第61-62页 |
| ·主要仪器和设备 | 第62页 |
| ·实验方法 | 第62-67页 |
| ·链霉菌原生质体制备 | 第62页 |
| ·链霉菌质粒转化 | 第62-63页 |
| ·链霉菌质粒提取 | 第63-64页 |
| ·PCR扩增安普霉素抗性基因 | 第64页 |
| ·柔红霉素产生菌的发酵培养和产物分析 | 第64-65页 |
| ·发酵产物中未知主产物的鉴定： | 第65页 |
| ·Southern Blotting | 第65-67页 |
| ·实验结果 | 第67-74页 |
| ·SIPI-1482的抗生素耐受浓度 | 第67页 |
| ·重组质粒的构建 | 第67-69页 |
| ·重组质粒(以下以pYG807为例)转化S.lividans TK24原生质体 | 第69-71页 |
| ·重组质粒转化SIPI-1482原生质体 | 第71页 |
| ·破坏子的筛选及验证 | 第71-73页 |
| ·发酵结果 | 第73-74页 |
| ·实验讨论 | 第74页 |
| ·结论 | 第74-76页 |
| 第4章 dnmV基因的阻断(二)——同源重组双交换法 | 第76-84页 |
| ·实验材料 | 第76-77页 |
| ·菌种和质粒 | 第76-77页 |
| ·培养基 | 第77页 |
| ·实验方法 | 第77-78页 |
| ·质粒碱变性单链化条件 | 第77页 |
| ·重组质粒的构建 | 第77页 |
| ·同源重组质粒转化链霉菌前的预处理 | 第77-78页 |
| ·实验结果 | 第78-82页 |
| ·重组质粒的构建 | 第78-79页 |
| ·同源重组质粒的转化及重组菌的筛选 | 第79页 |
| ·双交换重组菌的验证 | 第79-81页 |
| ·双交换重组菌的发酵产物分析 | 第81-82页 |
| ·基因阻断突变株的遗传稳定性分析 | 第82页 |
| ·实验讨论 | 第82-83页 |
| ·结论 | 第83-84页 |
| 第5章 C4酮基还原酶表达质粒的构建及工程菌发酵 | 第84-94页 |
| ·实验材料 | 第84-85页 |
| ·菌种和质粒 | 第84-85页 |
| ·培养基 | 第85页 |
| ·试剂 | 第85页 |
| ·实验结果 | 第85-92页 |
| ·重组质粒pYG810的构建 | 第85-87页 |
| ·重组质粒pYG812的构建 | 第87-88页 |
| ·重组质粒pYG810、pYG812转化双交换重组菌12# | 第88页 |
| ·重组质粒pYG820的构建 | 第88-89页 |
| ·重组质粒pYG821的构建 | 第89-91页 |
| ·含有各表达质粒的12#菌的发酵 | 第91-92页 |
| ·实验讨论 | 第92-93页 |
| ·结论 | 第93-94页 |
| 第6章 C4酮基还原酶的整合表达及表柔红霉素工程菌的研究 | 第94-112页 |
| ·实验材料 | 第94-95页 |
| ·菌种和质粒 | 第94-95页 |
| ·实验方法 | 第95-97页 |
| ·大肠杆菌JM110的相关操作 | 第95页 |
| ·碱变性单链化处理方法 | 第95页 |
| ·转化原生质体的重组质粒准备 | 第95-96页 |
| ·小量快速提取链霉菌总DNA | 第96页 |
| ·扩增长片段PCR反应体系 | 第96-97页 |
| ·发酵液LC-MS分析 | 第97页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第97页 |
| ·发酵条件单因素实验方法 | 第97页 |
| ·实验结果 | 第97-109页 |
| ·重组质粒的构建 | 第97-101页 |
| ·重组质粒转化SIPI-1482原生质体 | 第101-102页 |
| ·转化子的筛选 | 第102页 |
| ·转化子的验证 | 第102-105页 |
| ·各转化子发酵产物定性分析 | 第105-106页 |
| ·1482(pYG816-4)发酵产物LC-MS分析 | 第106页 |
| ·表柔红霉素标准曲线的绘制 | 第106页 |
| ·工程菌1482(pYG816-4)发酵条件及发酵液后处理的初步研究 | 第106-109页 |
| ·工程菌1482(pYG816-4)稳定性研究 | 第109页 |
| ·实验讨论 | 第109-110页 |
| ·结论 | 第110-112页 |
| 总结及创新点 | 第112-113页 |
| 参考文献 | 第113-118页 |
| 发表文章及申请专利 | 第118-119页 |
| 致谢 | 第119-120页 |
| 附录 | 第120-138页 |
