| 前言 | 第1-16页 |
| 第一部分 CEPO的生物信息学分析及转录本的鉴定 | 第16-44页 |
| 一、 核酸序列的同源性分析 | 第16-20页 |
| 1 电子延伸得到CEPO-A的cDNA序列 | 第16页 |
| 2 生物信息学分析得到CEPO-B的cDNA序列 | 第16-17页 |
| 3 CEPO-A核酸序列的同源性分析 | 第17-18页 |
| 4 CEPO-B核酸序列的同源性分析 | 第18-20页 |
| 二、 开放阅读框架分析及其编码氨基酸的序列特征 | 第20-23页 |
| 1 开放阅读框架(ORF)分析 | 第20-21页 |
| 2 氨基酸序列特征分析 | 第21-23页 |
| 三、 氨基酸序列对齐分析 | 第23-26页 |
| 1 CEPO-A氨基酸序列对齐分析 | 第23页 |
| 2 CEPO-B氨基酸序列对齐分析 | 第23-26页 |
| 四、 多序列对齐 | 第26-27页 |
| 五、 CEPO-A＼B cDNA序列的克隆 | 第27-30页 |
| 1 CEPO-A-cDNA的克隆 | 第27页 |
| 2 CEPO-B-cDNA的克隆 | 第27-28页 |
| 3 RT-PCR反应 | 第28-30页 |
| 六、 CEPO基因的染色体定位及基因组结构分析 | 第30-38页 |
| 1 染色体定位分析 | 第30页 |
| 2 基因组结构确定 | 第30-38页 |
| 七、 CEPO基因表达的组织分布及转录本大小判定 | 第38-42页 |
| 1 材料 | 第38页 |
| 2 方法 | 第38页 |
| 3 结果 | 第38-42页 |
| 八、 电子表达谱分析 | 第42页 |
| 九、 讨论 | 第42-43页 |
| 十、 小结 | 第43-44页 |
| 第二部分 CEPO的亚细胞定位 | 第44-68页 |
| 一、 利用GFP-CEPO融和蛋白进行CEPO的亚细胞定位 | 第44-51页 |
| 1 材料与方法 | 第44-47页 |
| 2 结果 | 第47-51页 |
| ·稳定转染细胞株的western检测 | 第47-48页 |
| ·CEPO-A与CEPO-B在NIH3T3细胞中稳定表达的定位结果 | 第48-49页 |
| ·稳定转染细胞株的激光共聚焦显微镜扫描观察 | 第49-50页 |
| ·稳定表达GFP-CEPO的NIH3T3细胞出现多亮点聚集现象 | 第50-51页 |
| 二、 GFP-CEPO稳定表达细胞的免疫组化分析 | 第51-55页 |
| 1 材料与方法 | 第51-52页 |
| 2 结果 | 第52-55页 |
| ·CEPO与γ-Tubulin共定位 | 第52-53页 |
| ·CEPO形成的多亮点与γ-Tubulin共定位 | 第53-55页 |
| 三、 CEPO的原核表达、多克隆抗体的制备及其纯化 | 第55-61页 |
| 1 CEPO-A和CEPO-B的原核表达 | 第55-56页 |
| 2 抗体制备 | 第56页 |
| 3 抗体纯化 | 第56页 |
| 4 ELISA法测定抗血清的效价 | 第56-57页 |
| 5 结果 | 第57-61页 |
| ·GST-CEPO-A和GST-CEPO-B融合蛋白的表达与纯化 | 第57-58页 |
| ·GST-CEPO-A和GST-CEPO-B融合蛋白表达的western检测 | 第58-59页 |
| ·ELISA测定结果 | 第59-61页 |
| 四、 CEPO在人源细胞中的亚细胞定位 | 第61-65页 |
| 1 材料和方法 | 第61-62页 |
| 2 结果 | 第62-65页 |
| ·用CEPO抗体检测内源性蛋白 | 第62-63页 |
| ·在HepG2细胞内用CEPO抗体对内源性蛋白的定位 | 第63-65页 |
| 五、 讨论 | 第65-67页 |
| 1 中心体组成物质概述 | 第65-66页 |
| 2 当一些中心体蛋白异位过表达时的结果 | 第66-67页 |
| 六、 小结 | 第67-68页 |
| 第三部分 CEPO的致癌基因功能 | 第68-79页 |
| 一、 CEPO异源过表达导致NIH3T3细胞在软琼脂中生长 | 第68-70页 |
| 1 材料和方法 | 第68-69页 |
| 2 结果 | 第69-70页 |
| 二、 CEPO异源过表达导致NIH3T3细胞在免疫缺损的小鼠皮下长成肿瘤 | 第70-72页 |
| 1 材料和方法 | 第70-71页 |
| 2 结果 | 第71-72页 |
| 三、 在肿瘤组织与正常对照组织中检测CEPO的表达情况 | 第72-75页 |
| 1 材料和方法 | 第72页 |
| 2 结果 | 第72-75页 |
| 四、 CEPO异源过表达导致细胞周期和染色体发生改变 | 第75-78页 |
| 1 材料和方法 | 第75页 |
| 2 结果 | 第75-78页 |
| ·处于S期的细胞数增多 | 第75-77页 |
| ·出现异倍体细胞 | 第77-78页 |
| 五、 讨论 | 第78页 |
| 六、 小结 | 第78-79页 |
| 第四部分 CEPO相互作用蛋白质的筛选 | 第79-95页 |
| 一、 酵母双杂交筛选人睾丸cDNA文库 | 第79-88页 |
| 1 材料和方法 | 第79-88页 |
| ·材料 | 第79页 |
| ·方法 | 第79-84页 |
| ·酵母的长期保存与复苏 | 第79页 |
| ·诱饵质粒pGBKT7-CEPO的构建及转化 | 第79-80页 |
| ·验证有无自身转录激活活性 | 第80-81页 |
| ·酵母蛋白的提取及鉴定 | 第81-82页 |
| ·大规模文库质粒(pACT2-DNA)转化与文库筛选 | 第82-83页 |
| ·用α-gal初步筛查阳性菌落 | 第83页 |
| ·小剂量提取酵母质粒 | 第83-84页 |
| ·结果 | 第84-88页 |
| ·与CEPO-A相互作用的阳性克隆的获得 | 第84-85页 |
| ·确定验证与CEPO-A是否存在真实的体内、外相互作用的对象 | 第85页 |
| ·与CEPO-B相互作用的阳性克隆的获得 | 第85-86页 |
| ·确定验证与CEPO-B是否存在真实的体内、外相互作用的对象 | 第86-88页 |
| 二、 CEPO与KIF3A相互作用的体外结合验证 | 第88-91页 |
| 1 材料和方法 | 第88-90页 |
| ·材料 | 第88页 |
| ·方法 | 第88-90页 |
| ·体外转录翻译合成KIF3A | 第88页 |
| ·体外结合实验 | 第88-90页 |
| 2 结果 | 第90-91页 |
| 三、 免疫共沉淀验证CEPO与KIF3A、JAB-1相互作用在细胞内存在的真实性 | 第91-94页 |
| 1 材料与方法 | 第91-92页 |
| ·材料 | 第91页 |
| ·方法 | 第91-92页 |
| ·共转染与细胞蛋白提取 | 第91页 |
| ·免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)流程 | 第91-92页 |
| 2 结果 | 第92-94页 |
| ·KIF3A与CEPO共转染蛋白的表达 | 第92页 |
| ·瞬时表达的CEPO和KIF3A在细胞内的相互作用 | 第92-93页 |
| ·瞬时表达的CEPO和JAB-1在细胞内的相互作用 | 第93-94页 |
| 四、 讨论 | 第94页 |
| 五、 小结 | 第94-95页 |
| 第五部分 CEPO通过JAB1介导的信号转导 | 第95-104页 |
| 一、 CEPO通过瞬时表达的JAB1激活AP-1转录活性 | 第95-99页 |
| 1 材料与方法 | 第95-96页 |
| ·材料 | 第95页 |
| ·方法 | 第95-96页 |
| ·载体构建 | 第95页 |
| ·Lipofectamine 2000转染方法 | 第95-96页 |
| ·荧光素酶活性测定 | 第96页 |
| 2 结果 | 第96-99页 |
| ·实验分组 | 第96-97页 |
| ·CEPO增强JAB1对转录因子AP-1的激活作用 | 第97-98页 |
| ·CEPO最佳转染量的确定 | 第98-99页 |
| 二、 各类阴性对照实验 | 第99-101页 |
| 1 材料与方法 | 第99页 |
| 2 结果 | 第99-101页 |
| 三、 JAB1反义核酸抑制CEPO对转录因子AP-1的激活作用 | 第101-103页 |
| 1 材料与方法 | 第101页 |
| ·材料 | 第101页 |
| ·方法 | 第101页 |
| 2 结果 | 第101-103页 |
| 四、 讨论 | 第103页 |
| 五、 小结 | 第103-104页 |
| 总讨论 | 第104-108页 |
| 结论 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-117页 |
| 文献综述(一) 中心体扩增与肿瘤 | 第117-126页 |
| 文献综述(二) HBx通过与宿主蛋白质的相互作用发挥多种调控功能 | 第126-132页 |
| 附录 | 第132-138页 |
| 一、 主要仪器设备 | 第132-133页 |
| 二. 主要溶液的配制 | 第133-136页 |
| 1 Western-blot相关试剂 | 第133页 |
| 2 蛋白提取相关溶液 | 第133-134页 |
| 3 细胞培养相关溶液 | 第134页 |
| 4 酵母双杂交实验有关试剂 | 第134-135页 |
| 5 双报告基因实验 | 第135页 |
| 6 体外转录翻译实验 | 第135-136页 |
| 三、 英文缩略词表 | 第136-137页 |
| 四、 博士期间发表的文章 | 第137页 |
| 五、 博士期间执笔的基金 | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138页 |
