| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-19页 |
| ·研究背景 | 第10-17页 |
| ·骨重建过程及意义 | 第10-13页 |
| ·分泌磷蛋白2(SPP2)研究进展 | 第13-17页 |
| ·研究目的及意义 | 第17-19页 |
| 第二章 实验材料 | 第19-26页 |
| ·材料与仪器 | 第19-20页 |
| ·组织材料来源 | 第19页 |
| ·载体与菌株 | 第19页 |
| ·主要仪器设备 | 第19-20页 |
| ·引物与试剂 | 第20-26页 |
| ·引物 | 第20页 |
| ·工具酶和主要生化试剂 | 第20-21页 |
| ·培养基试剂 | 第21页 |
| ·培养基的配制 | 第21-22页 |
| ·主要试剂和缓冲液的配制 | 第22-26页 |
| 第三章 实验方法 | 第26-47页 |
| ·人分泌磷蛋白2(SPP2)成熟蛋白编码区基因的克隆 | 第26-28页 |
| ·人肝癌组织总RNA的提取(TRIzol一步法) | 第26页 |
| ·人肝癌组织cDNA第一链的合成(逆转录) | 第26-27页 |
| ·PCR扩增人分泌磷蛋白2(SPP2)成熟蛋白编码区基因 | 第27页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第27-28页 |
| ·人分泌磷蛋白2(SPP2)成熟蛋白编码区基因表达载体的构建 | 第28-34页 |
| ·表达质粒pET-22b(+)的制备 | 第28-29页 |
| ·质粒和PCR产物的双酶切反应 | 第29页 |
| ·线状质粒pET-22b(+)的去磷酸化处理 | 第29-30页 |
| ·质粒双酶切产物的回收 | 第30-31页 |
| ·目的基因双酶切产物的回收 | 第31页 |
| ·PCR产物和质粒pET-22b(+)的双酶切产物的连接反应 | 第31页 |
| ·大肠杆菌TG1、BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞 | 第32页 |
| ·重组质粒pET-22b(+)-SPP2的菌落PCR鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组质粒pET-22b(+)-SPP2的酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·重组质粒pET-22b(+)-SPP2的外源基因序列的测定及正确性分析 | 第34页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的诱导表达 | 第34-38页 |
| ·重组质粒pET-22b(+)-SPP2转化E.coli BL21(DE3) | 第34页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第34-35页 |
| ·重组蛋白的可溶性分析 | 第35页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第35-37页 |
| ·重组菌表达诱导条件的优化 | 第37-38页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的纯化 | 第38-40页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的诱导表达 | 第38页 |
| ·样品的制备 | 第38页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的纯化 | 第38-39页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的透析、浓缩与保存 | 第39-40页 |
| ·考马斯亮蓝(Bradford)法测定重组蛋白浓度 | 第40页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的Western-blot鉴定 | 第40-43页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第40页 |
| ·蛋白电泳 | 第40-41页 |
| ·转膜(湿转) | 第41页 |
| ·免疫检测 | 第41-42页 |
| ·化学发光、显影和定影 | 第42页 |
| ·图像分析 | 第42-43页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的生物学活性检测 | 第43-47页 |
| ·木瓜蛋白酶活力的测定 | 第43页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)对木瓜蛋白酶的抑制作用 | 第43-44页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的热稳定性研究 | 第44-45页 |
| ·60℃下不同热处理时间对重组人分泌磷蛋白2(SPP2)抑制活性的影响 | 第45-47页 |
| 第四章 实验结果与分析 | 第47-70页 |
| ·人分泌磷蛋白2(SPP2)成熟蛋白编码区基因的克隆 | 第47-48页 |
| ·人肝癌组织总RNA的提取 | 第47页 |
| ·RT-PCR扩增人分泌磷蛋白2(SPP2)成熟蛋白编码区基因 | 第47-48页 |
| ·人分泌磷蛋白2(SPP2)成熟蛋白编码区基因表达载体的构建 | 第48-54页 |
| ·重组质粒pET-22b(+)-SPP2的构建及菌落PCR鉴定 | 第48-49页 |
| ·重组质粒的菌落PCR鉴定 | 第49-50页 |
| ·重组质粒pET-22b(+)-SPP2的酶切鉴定 | 第50-51页 |
| ·重组质粒pET-22b(+)-SPP2的外源基因序列的测定及正确性分析 | 第51-54页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的诱导表达 | 第54-57页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)表达菌株的构建 | 第54页 |
| ·重组菌的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析 | 第54-55页 |
| ·重组菌表达诱导条件的优化 | 第55-57页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的纯化与表达量分析 | 第57-60页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的纯化 | 第57-58页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的浓缩与浓度测定 | 第58-60页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的Western-blot鉴定 | 第60-61页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的生物学活性检测 | 第61-70页 |
| ·木瓜蛋白酶活力的测定 | 第61-62页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)对木瓜蛋白酶的抑制作用 | 第62-64页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的热稳定性研究 | 第64-67页 |
| ·60℃下不同热处理时间对重组人分泌磷蛋白2(SPP2)活性的影响 | 第67-70页 |
| 第五章 讨论 | 第70-76页 |
| ·人肝癌组织总RNA的抽提 | 第71-72页 |
| ·重组质粒pET-22b(+)-SPP2的构建及鉴定 | 第72-73页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的诱导表达 | 第73页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的纯化与鉴定 | 第73-74页 |
| ·重组人分泌磷蛋白2(SPP2)的活性检测 | 第74-75页 |
| ·后续研究 | 第75-76页 |
| 结论 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-84页 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
