| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 绪论 | 第11-20页 |
| 1.1 本课题研究的背景及意义 | 第11页 |
| 1.2 国内外研究现状 | 第11-19页 |
| 1.2.1 甲酸脱氢酶的主要来源与同源性分析 | 第11-12页 |
| 1.2.2 甲酸脱氢酶的主要性质 | 第12-13页 |
| 1.2.3 甲酸脱氢酶的催化机理及动力学研究 | 第13-14页 |
| 1.2.4 甲酸脱氢酶的基因克隆与表达 | 第14-15页 |
| 1.2.5 甲酸脱氢酶的蛋白质工程 | 第15-18页 |
| 1.2.6 甲酸脱氢酶的应用 | 第18-19页 |
| 1.3 本课题的研究内容 | 第19-20页 |
| 第2章 甲酸脱氢酶基因的合成和原核表达 | 第20-45页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第20-22页 |
| 2.1.1 试验所需药品 | 第20-21页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第21页 |
| 2.1.3 菌株及载体 | 第21页 |
| 2.1.4 培养基 | 第21页 |
| 2.1.5 试剂盒 | 第21-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-32页 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 | 第22-23页 |
| 2.2.2 甲酸脱氢酶基因的合成 | 第23-24页 |
| 2.2.3 DNA的纯化回收 | 第24-25页 |
| 2.2.4 克隆载体fdh-PEASY-T1的构建及测序 | 第25-29页 |
| 2.2.5 原核表达载体pETfdh的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.6 甲酸脱氢酶基因的原核表达 | 第30-32页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第32-44页 |
| 2.3.1 fdh基因合成 | 第32-34页 |
| 2.3.2 克隆载体fdh-PEASY-T1的构建及鉴定 | 第34-40页 |
| 2.3.3 表达载体的构建及鉴定 | 第40-42页 |
| 2.3.4 SDS-PAGE分析 | 第42-43页 |
| 2.3.5 粗酶比酶活的测定 | 第43-44页 |
| 2.4 本章小结 | 第44-45页 |
| 第3章 甲酸脱氢酶基因在毕赤酵母X33中的表达 | 第45-64页 |
| 3.1 材料和仪器 | 第45页 |
| 3.1.1 实验所需药品 | 第45页 |
| 3.1.2 实验所需仪器 | 第45页 |
| 3.1.3 培养基 | 第45页 |
| 3.2 实验方法 | 第45-52页 |
| 3.2.1 fdh的基因克隆 | 第45-46页 |
| 3.2.2 毕赤酵母穿梭载体pGAPZfdh的构建 | 第46-47页 |
| 3.2.3 毕赤酵母的转化 | 第47-50页 |
| 3.2.4 毕赤酵母转化子的筛选 | 第50-51页 |
| 3.2.5 甲酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第51-52页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第52-63页 |
| 3.3.1 fdh基因克隆 | 第52页 |
| 3.3.2 重组载体pGAPZ-fdh鉴定 | 第52-54页 |
| 3.3.3 氯化锂转化结果 | 第54页 |
| 3.3.4 PCR鉴定 | 第54-55页 |
| 3.3.5 转化子的筛选 | 第55-61页 |
| 3.3.6 蛋白含量检测 | 第61-63页 |
| 3.4 本章小结 | 第63-64页 |
| 第4章 甲酸脱氢酶基因的定点突变 | 第64-78页 |
| 4.1 材料和仪器 | 第64页 |
| 4.1.1 试验所需要品 | 第64页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第64页 |
| 4.2 实验方法 | 第64-67页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第64-65页 |
| 4.2.2 定点突变 | 第65-67页 |
| 4.2.3 克隆载体的构建 | 第67页 |
| 4.2.4 粗提质粒方法 | 第67页 |
| 4.2.5 突变体表达载体的构建 | 第67页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第67-76页 |
| 4.3.1 甲酸脱氢酶基因的定点突变、片段搭接及鉴定 | 第67-69页 |
| 4.3.2 TA克隆及鉴定 | 第69-71页 |
| 4.3.3 突变体表达载体的构建及鉴定 | 第71-72页 |
| 4.3.4 DNA序列测定、分析及比对 | 第72-75页 |
| 4.3.5 突变酶活及稳定性研究 | 第75-76页 |
| 4.4 本章小结 | 第76-78页 |
| 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
