米曲霉植酸酶的分离纯化、性质研究及其基因的克隆
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 第一章 绪论 | 第9-25页 |
| 1 植酸及植酸盐 | 第9-12页 |
| 2 植酸酶的研究的背景 | 第12-22页 |
| 2.1 植酸酶的研究历史及现状 | 第12-13页 |
| 2.2 植酸酶的分类 | 第13-16页 |
| 2.2.1 传统植酸酶的分类方法 | 第13-14页 |
| 2.2.2 新的植酸酶分类方法 | 第14-16页 |
| 2.2.2.1 组氨酸酸性磷酸酶 | 第14-15页 |
| 2.2.2.2 β螺旋桨式植酸酶 | 第15-16页 |
| 2.2.2.3 紫色酸性磷酸酶 | 第16页 |
| 2.3 植酸酶的研究热点 | 第16-20页 |
| 2.3.1 植酸酶那热性研究 | 第16-17页 |
| 2.3.2 植酸酶空间构象研究 | 第17-18页 |
| 2.3.3 植酸酶的晶体结构分析 | 第18-20页 |
| 2.4 植酸酶的分子研究 | 第20-22页 |
| 2.4.1 植酸酶基因高效表达 | 第20页 |
| 2.4.2 植酸酶基因的分子改造 | 第20-21页 |
| 2.4.3 转植酸酶基因植物的研究 | 第21页 |
| 2.4.4 转植酸酶基因动物的研究 | 第21-22页 |
| 3 植酸酶的序列分析 | 第22-23页 |
| 3.1 来源于丝状真菌的植酸酶基因 | 第22页 |
| 3.2 来源于细菌的植酸酶基因 | 第22-23页 |
| 3.3 来源于植物的植酸酶基因 | 第23页 |
| 4 植酸酶商品化 | 第23-24页 |
| 5 本课题研究意义 | 第24-25页 |
| 第二章 发酵条件优化 | 第25-34页 |
| 1 材料与方法 | 第25-26页 |
| 1.1 材料 | 第25-26页 |
| 1.1.1 菌种 | 第25页 |
| 1.1.2 培养基 | 第25页 |
| 1.1.3 试剂 | 第25页 |
| 1.1.4 仪器 | 第25-26页 |
| 2 实验方法与步骤 | 第26-27页 |
| 2.1 发酵 | 第26页 |
| 2.1.1 孢子悬液的制备 | 第26页 |
| 2.1.2 菌种发酵 | 第26页 |
| 2.2 粗酶液的制取 | 第26页 |
| 2.3 植酸酶酶活的定义及检测 | 第26-27页 |
| 2.3.1 酶活定义 | 第26页 |
| 2.3.2 酶活测定方法 | 第26-27页 |
| 2.3.3 定磷标准曲线 | 第27页 |
| 3 结果与讨论 | 第27-32页 |
| 3.1 定磷标准曲线的绘制 | 第27-28页 |
| 3.2 米曲霉植酸酶产酶进程及接种量对产酶的影响 | 第28-29页 |
| 3.2.1 米曲霉产植酸酶进程 | 第28-29页 |
| 3.2.2 接种量对产酶的影想 | 第29页 |
| 3.3 通气量对米曲霉产植酸酶的影响 | 第29-30页 |
| 3.4 碳源对米曲霉产植酸酶的影响 | 第30-31页 |
| 3.5 氮源对米曲霉产植酸酶的影响 | 第31页 |
| 3.6 发酵培养基中加入植酸钙对发酵的影响 | 第31-32页 |
| 3.7 优化后的产酶曲线 | 第32页 |
| 4 小结 | 第32-34页 |
| 第三章 米曲霉植酸酶的纯化及性质研究 | 第34-45页 |
| 1 材料与方法 | 第34-38页 |
| 1.1 材料 | 第34-36页 |
| 1.1.1 菌株 | 第34页 |
| 1.1.2 培养基 | 第34页 |
| 1.1.3 试剂 | 第34-35页 |
| 1.1.4 仪器 | 第35-36页 |
| 1.2 方法 | 第36-38页 |
| 1.2.1 粗酶液的制备 | 第36页 |
| 1.2.2 米曲霉植酸酶的分离纯化 | 第36-38页 |
| 1.3 SDS-PAGE垂直板电泳 | 第38页 |
| 1.4 植酸酶收率的计算 | 第38页 |
| 2 植酸酶性质的研究 | 第38页 |
| 2.1 反应温度对米曲霉植酸酶活性的影响 | 第38页 |
| 2.2 米曲霉植酸酶最适反应pH值的测定 | 第38页 |
| 2.3 米曲霉植酸酶热稳定性的测定 | 第38页 |
| 2.4 米曲霉植酸酶对于金属离子的耐受 | 第38页 |
| 3 结果与讨论 | 第38-44页 |
| 3.1 米曲霉植酸酶的分离与纯化流程 | 第38-40页 |
| 3.2 反应温度对植酸酶活性的影响 | 第40-41页 |
| 3.3 pH值对植酸酶活性的影响 | 第41-42页 |
| 3.4 米曲霉植酸酶热稳定性 | 第42-43页 |
| 3.5 金属离子对米曲霉植酸酶活性的影响 | 第43-44页 |
| 4 小结 | 第44-45页 |
| 第四章 米曲霉植酸酶活性中心的研究 | 第45-50页 |
| 1 材料与方法 | 第45-46页 |
| 1.1 试剂 | 第45页 |
| 1.2 实验方法 | 第45-46页 |
| 1.2.1 精氨酸的化学修饰 | 第45页 |
| 1.2.2 组氨酸的化学修饰 | 第45-46页 |
| 1.2.3 氨基的化学修饰 | 第46页 |
| 2 结果与讨论 | 第46-48页 |
| 2.1 精氨酸的化学修饰结果 | 第46-47页 |
| 2.2 组氨酸的化学修饰结果 | 第47页 |
| 2.3 氨基的化学修饰结果 | 第47-48页 |
| 2.4 二硫键的化学修饰 | 第48页 |
| 3 小结 | 第48-50页 |
| 第五章 米曲霉植酸酶基因的克隆 | 第50-62页 |
| 1 材料与方法 | 第50-55页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第50页 |
| 1.2 试剂 | 第50-51页 |
| 1.3 培养基及培养条件 | 第51页 |
| 1.4 DNA克隆技术 | 第51-55页 |
| 1.4.1 米曲霉染色体总DNA提取和纯化 | 第51-52页 |
| 1.4.2 PCR引物设计合成 | 第52页 |
| 1.4.3 PCR扩增反应 | 第52-53页 |
| 1.4.4 琼脂糖凝胶电泳技术 | 第53页 |
| 1.4.5 PCR样品的纯化 | 第53页 |
| 1.4.6 连接反应 | 第53-54页 |
| 1.4.7 CaCl_2法转化大肠杆菌 | 第54页 |
| 1.4.8 重组质粒的筛选 | 第54页 |
| 1.4.9 转化质粒的提取 | 第54-55页 |
| 2 结果与讨论 | 第55-60页 |
| 2.1 米曲霉植酸酶基因的克隆 | 第55页 |
| 2.2 米曲霉植酸酶基因phyA的鉴定 | 第55-56页 |
| 2.3 分析 | 第56-60页 |
| 2.3.1 米曲霉植酸酶基因全序列测定 | 第56-57页 |
| 2.3.2 序列分析 | 第57-59页 |
| 2.3.3 米曲霉植酸酶结构预测 | 第59-60页 |
| 3 小结 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第66页 |
