| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第14-22页 |
| 1.1 卤醇脱卤酶的概述 | 第14-18页 |
| 1.1.1 卤醇脱卤酶的简介 | 第14页 |
| 1.1.2 卤醇脱卤酶的分类 | 第14-15页 |
| 1.1.3 卤醇脱卤酶的催化机理 | 第15-16页 |
| 1.1.4 卤醇脱卤酶的应用研究 | 第16-18页 |
| 1.1.4.1 卤醇脱卤酶脱卤反应的应用研究 | 第16页 |
| 1.1.4.2 卤醇脱卤酶开环反应的应用研究 | 第16-17页 |
| 1.1.4.3 卤醇脱卤酶工业应用的拓展研究 | 第17-18页 |
| 1.2 酶进化策略概述 | 第18-20页 |
| 1.2.1 理性进化策略概述 | 第18页 |
| 1.2.2 非理性进化策略概述 | 第18-19页 |
| 1.2.3 半理性进化策略概述 | 第19-20页 |
| 1.3 本论文的主要内容 | 第20页 |
| 1.4 本研究意义和目的 | 第20-21页 |
| 1.5 本论文的结构安排 | 第21-22页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第22-34页 |
| 2.1 实验材料 | 第22页 |
| 2.2 实验试剂 | 第22页 |
| 2.3 溶液配制 | 第22-25页 |
| 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测实验溶液配制 | 第22页 |
| 2.3.2 转化感受态细胞制备实验溶液配制 | 第22-23页 |
| 2.3.3 突变体文库比色筛选实验溶液配制 | 第23页 |
| 2.3.4 突变体表达及纯化实验溶液配制 | 第23页 |
| 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验溶液配制 | 第23-24页 |
| 2.3.6 酶活性测定实验溶液配制 | 第24-25页 |
| 2.4 实验方法 | 第25-34页 |
| 2.4.1 卤醇脱卤酶突变体基因扩增 | 第25-27页 |
| 2.4.1.1 PCR扩增卤醇脱卤酶突变体基因 | 第25-26页 |
| 2.4.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果 | 第26页 |
| 2.4.1.3 琼脂糖凝胶回收PCR扩增片段 | 第26页 |
| 2.4.1.4 限制性内切酶消化PCR产物 | 第26-27页 |
| 2.4.2 卤醇脱卤酶突变体文库构建及筛选 | 第27-30页 |
| 2.4.2.1 卤醇脱卤酶突变体文库构建 | 第27-28页 |
| 2.4.2.2 卤醇脱卤酶突变体文库筛选 | 第28-29页 |
| 2.4.2.3 卤醇脱卤酶突变体质粒提取 | 第29-30页 |
| 2.4.3 卤醇脱卤酶突变体诱导表达及纯化 | 第30-32页 |
| 2.4.3.1 卤醇脱卤酶突变体诱导表达 | 第30页 |
| 2.4.3.2 阴离子交换层析纯化酶蛋白 | 第30-31页 |
| 2.4.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化效果 | 第31-32页 |
| 2.4.3.4 紫外法测定纯化酶蛋白浓度 | 第32页 |
| 2.4.4 卤醇脱卤酶催化活性和热稳定性测定 | 第32-34页 |
| 第三章 卤醇脱卤酶碳末端功能研究 | 第34-52页 |
| 3.1 概述 | 第34页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第34-35页 |
| 3.3 实验结果和分析 | 第35-49页 |
| 3.3.1 卤醇脱卤酶碳末端功能研究区域的选择 | 第35-36页 |
| 3.3.2 碳末端缺失突变体功能研究 | 第36-39页 |
| 3.3.2.1 碳末端缺失突变体构建 | 第36-38页 |
| 3.3.2.2 碳末端缺失突变体表达纯化及功能检测 | 第38-39页 |
| 3.3.3 碳末端单点饱和突变研究 | 第39-49页 |
| 3.3.3.1 单点饱和突变体文库构建 | 第39-41页 |
| 3.3.3.2 单点饱和突变体文库筛选 | 第41-42页 |
| 3.3.3.3 优势突变体表达纯化及功能检测 | 第42-44页 |
| 3.3.3.4 优势突变体结构与计算分析 | 第44-49页 |
| 3.4 讨论 | 第49-51页 |
| 3.5 小结 | 第51-52页 |
| 第四章 创建非连续多位点快速进化策略 | 第52-66页 |
| 4.1 概述 | 第52页 |
| 4.2 实验材料和方法 | 第52-53页 |
| 4.3 实验结果和分析 | 第53-62页 |
| 4.3.1 常见的多位点重组进化策略比较 | 第53-54页 |
| 4.3.2 创建非连续多位点快速进化策略 | 第54-55页 |
| 4.3.3 非连续多位点快速进化策略运用实例 | 第55-61页 |
| 4.3.3.1 多位点快速进化改造的区域选择 | 第55页 |
| 4.3.3.2 单点饱和突变体文库构建及筛选 | 第55-58页 |
| 4.3.3.3 多位点快速重组引物设计 | 第58页 |
| 4.3.3.4 多位点重组突变体文库构建及筛选 | 第58-59页 |
| 4.3.3.5 多位点重组突变体表达纯化及酶活检测 | 第59-61页 |
| 4.3.4 迭代式饱和突变策略实例对比研究 | 第61-62页 |
| 4.3.4.1 迭代式饱和突变策略的实施流程 | 第61页 |
| 4.3.4.2 迭代式饱和突变策略的实例对比 | 第61-62页 |
| 4.4 讨论 | 第62-65页 |
| 4.5 小结 | 第65-66页 |
| 第五章 创建连续多位点快速进化策略 | 第66-82页 |
| 5.1 概述 | 第66页 |
| 5.2 实验材料和方法 | 第66-67页 |
| 5.3 实验结果和分析 | 第67-78页 |
| 5.3.1 多位点重组简并密码子工具的设计 | 第67-69页 |
| 5.3.2 创建连续多位点快速进化策略 | 第69-70页 |
| 5.3.3 连续多位点快速进化策略运用实例一 | 第70-75页 |
| 5.3.3.1 多位点快速进化改造的区域选择 | 第70页 |
| 5.3.3.2 单点饱和突变体文库构建及筛选 | 第70-72页 |
| 5.3.3.3 多位点快速重组突变引物设计 | 第72-73页 |
| 5.3.3.4 多位点重组突变体文库构建及筛选 | 第73-74页 |
| 5.3.3.5 多位点重组突变体表达纯化及酶活检测 | 第74-75页 |
| 5.3.4 连续多位点快速进化策略运用实例二 | 第75-78页 |
| 5.3.4.1 多位点快速进化改造的区域选择 | 第75-77页 |
| 5.3.4.2 多位点快速重组引物设计 | 第77页 |
| 5.3.4.3 多位点重组突变体文库构建及筛选 | 第77-78页 |
| 5.3.4.4 多位点重组突变体表达纯化及功能检测 | 第78页 |
| 5.4 讨论 | 第78-81页 |
| 5.5 小结 | 第81-82页 |
| 第六章 卤醇脱卤酶碳末端多位点重组研究 | 第82-92页 |
| 6.1 概述 | 第82页 |
| 6.2 实验材料和方法 | 第82-83页 |
| 6.3 实验结果和分析 | 第83-89页 |
| 6.3.1 碳末端非连续多位点快速进化研究 | 第83-85页 |
| 6.3.1.1 非连续多位点快速重组引物设计 | 第83-84页 |
| 6.3.1.2 非连续多位点重组突变体文库构建及筛选 | 第84页 |
| 6.3.1.3 非连续多位点重组突变体表达纯化及功能检测 | 第84-85页 |
| 6.3.2 碳末端连续多位点快速进化研究 | 第85-87页 |
| 6.3.2.1 连续多位点快速重组引物设计 | 第85页 |
| 6.3.2.2 连续多位点重组突变体文库构建及筛选 | 第85-86页 |
| 6.3.2.3 连续多位点重组突变体表达纯化及功能检测 | 第86-87页 |
| 6.3.3 碳末端多位点重组突变体结构分析 | 第87-89页 |
| 6.4 讨论 | 第89-90页 |
| 6.5 小结 | 第90-92页 |
| 第七章 结论 | 第92-94页 |
| 7.1 本论文的主要结论 | 第92-93页 |
| 7.2 下一步工作的展望 | 第93-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-108页 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 | 第108-109页 |
