| 摘要 | 第10-12页 |
| 英文摘要 | 第12-14页 |
| 1 前言 | 第15-31页 |
| 1.1 牛肠道病毒概述 | 第16-23页 |
| 1.1.1 形态结构与理化性质 | 第16-17页 |
| 1.1.2 基因结构及功能 | 第17-18页 |
| 1.1.3 病毒的分类 | 第18-19页 |
| 1.1.4 病毒的感染与复制 | 第19-23页 |
| 1.2 牛肠道病毒的流行现状 | 第23-27页 |
| 1.2.1 国外流行现状 | 第23-25页 |
| 1.2.2 国内流行现状 | 第25-26页 |
| 1.2.3 牛肠道病毒的检测技术 | 第26-27页 |
| 1.3 RNA病毒的反向遗传学研究 | 第27-30页 |
| 1.3.1 反向遗传学概述 | 第27页 |
| 1.3.2 RNA病毒反向遗传学发展历程 | 第27-28页 |
| 1.3.3 反向遗传学在肠道病毒中的应用 | 第28-30页 |
| 1.4 本研究的目的与意义 | 第30-31页 |
| 2 材料与方法 | 第31-56页 |
| 2.1 材料 | 第31-33页 |
| 2.1.1 试验动物、病料、血清 | 第31页 |
| 2.1.2 细胞、病毒、培养基 | 第31-32页 |
| 2.1.3 质粒与菌株 | 第32页 |
| 2.1.4 酶类与主要试剂 | 第32页 |
| 2.1.5 主要设备和仪器 | 第32-33页 |
| 2.1.6 试剂配制 | 第33页 |
| 2.1.7 试验参考毒株序列信息 | 第33页 |
| 2.2 牛肠道病毒的分离与鉴定 | 第33-40页 |
| 2.2.1 病料的处理 | 第33页 |
| 2.2.2 病毒的分离 | 第33页 |
| 2.2.3 病毒TCID50测定 | 第33-35页 |
| 2.2.4 病毒的蚀斑纯化 | 第35页 |
| 2.2.5 病毒的核酸型鉴定 | 第35页 |
| 2.2.6 随机RT-PCR鉴定第一批病料 | 第35-38页 |
| 2.2.7 RT-PCR鉴定第二批病料 | 第38页 |
| 2.2.8 病毒的鉴定 | 第38-40页 |
| 2.3 乳鼠感染模型的建立 | 第40-43页 |
| 2.3.1 感染模型的建立 | 第40-42页 |
| 2.3.2 多重感染模型的建立 | 第42-43页 |
| 2.4 牛肠道病毒的全基因克隆 | 第43-48页 |
| 2.4.1 引物设计 | 第43页 |
| 2.4.2 病毒m RNA的提取 | 第43页 |
| 2.4.3 5’RACE法扩增 5’端片段 | 第43-46页 |
| 2.4.4 其它目的片段扩增 | 第46-47页 |
| 2.4.5 PCR产物的纯化与回收 | 第47页 |
| 2.4.6 PCR产物的连接与转化 | 第47页 |
| 2.4.7 重组质粒的鉴定及测序 | 第47-48页 |
| 2.4.8 全基因序列的拼接和分析 | 第48页 |
| 2.5 HLJ-3531株重组病毒的拯救 | 第48-56页 |
| 2.5.1 引物设计及连接策略 | 第48-49页 |
| 2.5.2 病毒RNA的提取 | 第49页 |
| 2.5.3 PCR反应扩增目的基因 | 第49-51页 |
| 2.5.4 克隆载体的构建 | 第51-53页 |
| 2.5.5 全长重组克隆载体p BSK-3531的构建 | 第53页 |
| 2.5.6 重组病毒的拯救 | 第53-54页 |
| 2.5.7 重组病毒的鉴定 | 第54-55页 |
| 2.5.8 重组病毒生物学特性的研究 | 第55-56页 |
| 3 结果与分析 | 第56-95页 |
| 3.1 牛肠道病毒的分离鉴定 | 第56-68页 |
| 3.1.1 病毒的分离 | 第56页 |
| 3.1.2 病毒的TCID50测定 | 第56-57页 |
| 3.1.3 病毒的蚀斑纯化 | 第57页 |
| 3.1.4 病毒的核酸型鉴定 | 第57-59页 |
| 3.1.5 第一批病料PCR鉴定结果 | 第59-61页 |
| 3.1.6 第二批病料PCR鉴定结果 | 第61-62页 |
| 3.1.7 病毒的鉴定 | 第62-68页 |
| 3.2 乳鼠感染模型建立 | 第68-79页 |
| 3.2.1 感染模型建立 | 第68-75页 |
| 3.2.2 多重感染模型的建立 | 第75-79页 |
| 3.3 牛肠道病毒的全基因克隆 | 第79-89页 |
| 3.3.1 5’端的克隆 | 第79-80页 |
| 3.3.2 其他片段的扩增与鉴定 | 第80-82页 |
| 3.3.3 序列拼接及基因组结构分析 | 第82-84页 |
| 3.3.4 N-糖基化位点比较分析 | 第84-85页 |
| 3.3.5 进化树分析 | 第85-88页 |
| 3.3.6 VP1氨基酸比对 | 第88-89页 |
| 3.4 HLJ-3531株感染性分子克隆的建立 | 第89-95页 |
| 3.4.1 3531-A、3531-B片段的克隆 | 第89页 |
| 3.4.2 重组克隆载体构建结果 | 第89-90页 |
| 3.4.3 全长重组克隆载体p BSK-3531的构建结果 | 第90-91页 |
| 3.4.4 重组病毒的拯救 | 第91页 |
| 3.4.5 重组病毒r HLJ-3531的鉴定 | 第91-93页 |
| 3.4.6 重组病毒r HLJ-3531的特性研究 | 第93-95页 |
| 4 讨论 | 第95-101页 |
| 4.1 牛肠道病毒的分离鉴定 | 第95页 |
| 4.2 两株病毒的宿主嗜性分析 | 第95-96页 |
| 4.3 动物模型的建立及组织分布 | 第96-97页 |
| 4.3.1 感染动物的选择 | 第96页 |
| 4.3.2 感染方式的选择 | 第96-97页 |
| 4.3.3 感染组织分布 | 第97页 |
| 4.3.4 两株病毒乳鼠感染模型差异的分析 | 第97页 |
| 4.4 病毒的全基因序列克隆方法的分析 | 第97-99页 |
| 4.4.1 全基因克隆策略的选择 | 第97-98页 |
| 4.4.2 RACE扩增法及其影响因素 | 第98-99页 |
| 4.5 两株牛肠道病毒的分类分析 | 第99页 |
| 4.6 HLJ-3531的感染性克隆构建 | 第99-101页 |
| 4.6.1 全长c DNA构建策略 | 第99-100页 |
| 4.6.2 重组病毒的鉴定 | 第100-101页 |
| 5 结论 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-112页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第112页 |
